哈萨克斯坦和俄罗斯主要盐湖卤虫卵生物学和营养学特性分析

杜东东，高美荣，张 波，隋丽英

(亚洲区域卤虫参考中心，天津科技大学海洋与环境学院，天津300457)

卤虫(Artemia)广泛分布于日晒盐场和内陆盐湖高盐水体中，是高盐生态系统的主要生物种，一般认为卤虫属包含 6个两性种 A.salina、A.urmiana、A.sinica、A.tibetiana、A.persimilis、A.franciscana 和1个孤雌生殖种群[1-6]．卤虫幼体和成虫是海水苗种极佳的鲜活饵料．初孵的卤虫无节幼体具有大量卵黄，含有丰富的蛋白质和不饱和脂肪酸，可满足海水甲壳类和鱼类幼体的营养需求．但不同品系和产地卤虫卵卵径大小、营养组成和孵化特性等方面差别较大[7-9]，这些特性与其在水产养殖中的应用密切相关.

由于卤虫休眠卵贮存方便和易于孵化操作而成为世界卤虫贸易的主要商品．水产养殖业的快速发展对卤虫资源的需求日益增加，卤虫卵每年的产量大约 3000～4000t(成品干质量)，原料主要来自美国、中国、俄罗斯和哈萨克斯坦[10]．中国作为水产养殖大国，卤虫卵年需求量达 1000～1500t(成品干质量).近年来，哈萨克斯坦和俄罗斯成为中国卤虫卵原料的主要进口国，约占我国卤虫卵原料市场 50%，而针对这些新近开发的卤虫资源品系特性研究较少[11-12].本文选取俄罗斯和哈萨克斯坦主要盐湖的卤虫卵进行生物学测定值和营养组分分析，并选取3个产量较大的卤虫品系进行不同温度下孵化特性研究，研究结果对解析中亚地区盐湖卤虫卵品系特性，促进其在水产育苗中有效应用具有重要意义．

1 材料与方法

1.1 卤虫品系基本信息

本研究所用卤虫卵为经过去休眠加工的商品卤虫卵，基本信息见表1．

表1 卤虫卵品系信息Tab. 1 Information of the Artemia cysts

1.2 生物学指标测定

水合卵径测定：称取适量卤虫干卵放锥形管中，加入 30mL稀释卤水(盐度 3%)，连续充气水合 3h.在显微镜(Leica DM500)下测定卵径，每个卤虫品系测定100个．

脱壳卵径测定：向充分水合的卤虫卵加入脱壳液脱壳，待卤虫卵颜色变为橙色即为脱壳完全．在显微镜下测定卵径，每个卤虫品系测定100个．

卤虫卵壳厚度(µm)按照式(1)计算．

Ⅰ期无节幼体体长测定：称取 0.4g干制卤虫卵放置于孵化管中，加入200mL稀释卤水(盐度3%)，水浴控温28℃，持续光照(2000 lx)，连续充气18h，在显微镜下测定Ⅰ期无节幼体体长，每个品系测定100只．

1.3 孵化率测定

准确称取 0.4g卤虫卵，置于装有 200mL人工海水(盐度 3%)的孵化管中，连续充气，持续光照(2000 lx)，水浴控温分别为25℃、28℃和31℃，每个品系每个温度设置 3个平行．孵化第 12h开始取样，每4h取样1次，共取样7次，至36h结束．卤虫卵孵化率(H)按照式(2)计算．

式中：N表示无节幼体数；U表示伞状幼数；E表示胚胎数．

1.4 孵化同步性测定

以测定的最高孵化率为 100%，计算每次取样的孵化率与最高孵化率的相对值，采用二元二次方程，拟合计算 10%和 90%卤虫卵孵化为无节幼体需要的时间t10和t90，孵化同步性ts按照式(3)计算[14]．

1.5 营养成分测定

参照 GB/T 6432—1994《饲料中粗蛋白测定方法》，称取干燥的脱壳卤虫卵 0.5～0.8g，利用凯氏定氮仪(丹麦FOSS Kjeltec 8400)测定粗蛋白含量．

取0.1g左右脱壳卤虫湿卵，准确加入1mg内标液(C20∶2n-6，NU-CHEK PREP公司)，向混合物中加入 5 mL甲醇/甲苯混合液(体积比为 3﹕2)，采用高速分散机破碎组织，再加入新配制的氯乙酰/甲醇混合液(体积比为 1﹕20)水浴 1h(100℃)，最后用正己烷萃取脂肪酸甲酯并浓缩[13]．利用 GC-2014型气相色谱仪(日本岛津公司)对脂肪酸进行定性和定量测定．色谱条件：毛细柱 FFAP；高纯氮气载气；程序升温初始温度60℃，以10℃/min速率升至220℃保持 15min；气化室温度 280℃；FID 检测器温度280℃；柱压95.4kPa；分配比率30．

1.6 数据统计学分析

数据采用“平均值±标准差”表示．用 SPSS 19.0 统计软件对实验数据进行统计分析．采用 One Way ANOVA对结果进行单因素方差分析，采用Turkey 多重比较法检验，不同字母表示组间存在显著差异(P＜0.05)．

2 结果与分析

2.1 卤虫卵生物学指标

11个品系卤虫卵生物学指标测定值存在较大差异(表 2)，水合卵径为 251.3～287.1µm，脱壳卵径为235.5～265.2µm，卵壳厚度为 4.9～12.2µm．综合分析，除K1(Marandy盐湖)外，哈萨克斯坦卤虫卵水合卵径和脱壳卵径均比俄罗斯的卵大．Ⅰ期无节幼体体长为429.1～500.8µm．

表2 不同品系卤虫卵生物学指标(n＝100)Tab. 2 Biometrics of the Artemia cysts(n＝100)

2.2 卤虫卵孵化率

Tike盐湖卤虫卵(K3)、Halibiekoe盐湖卤虫卵(K4)和 Kuchuk盐湖卤虫卵品系(R3)不同温度下的孵化速率如图1所示．

K3品系在 25、28、31℃下，16h孵化率分别为0.0%、57.3%和 48.7%，28℃孵化率显著高于其他温度的(P＜0.05)；24h在 3个温度下孵化率无显著差异(P＞0.05)，分别为 84.0%、85.3%和 82.3%；28～36h趋于稳定，无显著变化．

K4品系在 25、28、31℃下，16h孵化率分别为0.0%、37.3%和 15.0%，28℃孵化率显著高于其他两个温度的(P＜0.05)；24h孵化率分别为 84.0%、73.7%和 39.0%，25℃和 28℃孵化率无显著性差异(P＞0.05)，但均显著高于 31℃的(P＜0.05)；28～36h，31℃孵化率显著增加，其他温度下孵化率趋于稳定．

R3品系在 25、28、31℃下，16h孵化率均为0.0%；20h孵化率分别为 0.0%、44.3%和 33.0%，28℃孵化率显著高于其他两个温度的(P＜0.05)；24h孵化率分别为 54.3%、76.0%和 48.0%，25℃和31℃孵化率无显著差异(P＞0.05)，但均显著低于28℃的(P＜0.05)；28～36h，25℃和 31℃孵化率显著增加(P＜0.05)，28℃趋于稳定．

2.3 卤虫卵孵化同步性

K3、K4和 R3品系卤虫卵在不同温度下孵化同步性见表 3．K3和 K4品系在 25℃同步性较好，R3品系在25℃和28℃同步性较好．

表3 不同温度下Tike、Halibiekoe和Kuchuk盐湖卤虫卵孵化同步性Tab. 3 Hatching synchrony of Artemia cysts from Tike，Halibiekoe and Kuchuk lakes at different temperatures

2.4 卤虫卵粗蛋白和脂肪酸含量

卤虫卵粗蛋白和脂肪酸含量(以干质量计)测定结果见表 4．11个品系卤虫卵粗蛋白含量为49.19%～54.09%．各品系卤虫卵脂肪酸组成及含量差别较大，其中棕榈酸C16∶0，油酸C18∶1和亚麻酸C18∶3含量普遍较高．11个品系均含有二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA，C20∶5)，含量为0.63～13.24mg/g，其中 K1、K3和 R3含量较低，11个品系均未检测出二十二碳六烯酸(docose hexaenoie acid，DHA，C22∶6)．

表4 不同品系卤虫卵粗蛋白和脂肪酸含量Tab. 4 Crude protein and fatty acid profile of the Artemia cysts

3 讨 论

卤虫卵孵化率和同步性、卵径大小、脂肪酸组成和含量等与其在水产育苗中的应用密切相关．孵化率和同步性好、卵径小和不饱和脂肪酸(PUFA)含量高的卤虫卵产品市场价格较高．

卤虫卵径范围一般在 200～300µm，按照卤虫卵卵径和壳厚度，将卤虫卵分为三类[7]：第一类以旧金山卤虫卵为代表，卵径较小；第二类以欧亚大陆的孤雌生殖卤虫为代表，卵径较大；第三类以美国大盐湖卤虫为代表，卵径中等但卵壳较薄．本研究中 11个品系卤虫卵水合卵径 251.3～287.1µm，与上述欧亚大陆卤虫卵的特性相似．11个品系中 Tike盐湖品系卤虫卵径和卵壳厚度最大；Marandy、Kezilkak、Karalvoe和Ebeity盐湖品系卵壳厚度中等，为7.7～8.6µm ；Halibiekoe、Jalmantuze、Big Yarovoe、Kunlundinskoe和Kuchuk盐湖品系卵壳厚度较小，为4.9～6.0µm，表明卵壳厚度和卵径大小无明显相关性．本研究中除哈萨克斯坦Marandy盐湖品系外，俄罗斯卤虫卵品系水合卵径和脱壳卵径稍小于哈萨克斯坦卤虫卵品系．

卤虫卵的孵化率除了受品系特性影响外，还与去休眠和加工过程有一定关系．本研究针对经过去休眠加工的商品卤虫卵进行相关研究．温度、盐度和光照是影响卤虫卵孵化率的最重要的因素，最适孵化盐度为 0.5%～3.5%，最适的孵化温度为 25～28℃，在低于25℃时孵化率降低，在高于33℃时虫卵代谢几乎停止[14-15]．孵化同步性是评价卤虫卵质量的重要指标之一，优质卤虫卵的孵化同步性应在 8h之内，大于 10h则孵化同步性偏低[14]．孵化同步性高的卤虫卵，产出无节幼体的时段较集中、大小较均一，有利于其作为育苗饵料的使用．从方便应用的角度考虑，卤虫卵孵化率24h内达到最高为好．Tike盐湖品系卤虫卵在 25、28、31℃温度下 24h孵化率无显著性差异(P＜0.05)，说明该品系卤虫卵对温度适应范围广，且该品系在 25℃孵化同步性为 7.7h，同步性较好．Halibiekoe盐湖品系卤虫卵在 25℃和 28℃下24h孵化率均显著高于 31℃的(P＜0.05)，说明 K4品系卤虫卵适合在较低温度下孵化，且 25℃孵化同步性较好(8.2h)，说明 25℃为该品系最适孵化温度．Kuchuk盐湖品系卤虫卵在 28℃下 24h孵化率显著高于 25℃和 31℃的(P＜0.05)，因此该品系在28℃孵化较好．应该指出的是，K3和 K4品系卤虫卵在实际测量中，25℃ 16h和28℃ 12h孵化率均为0%，而根据拟合孵化率方程计算 25℃ t10分别为15.6h和 15.7h，28℃ t10分别为 11.9h和 10.6h，早于实际孵化时间，分析原因可能与方程的拟合度略低相关．Speer等[16]研究卤虫种群特异性显示，不同产地的 Artemia franciscana卤虫卵在不同光照和盐度下孵化率有显著差异．王玉清等[17]研究表明，渤海湾卤虫卵的最适孵化盐度为4%～4.5%，在盐度低于2%或高于 5.5%时孵化率均显著降低．本研究中分析的3个产量较大品系卤虫卵在不同温度下孵化特性存在显著性差异，可能与卤虫对不同盐湖产地的非生物环境适应性相关．

卤虫的营养组成与其饵料来源和生长环境有关，不同品系卤虫的营养组成有较大差别[14,18]．卤虫作为生物饵料的营养价值主要在于它含有较高的蛋白质和不饱和脂肪酸．卤虫及卤虫卵粗蛋白含量一般为40%～60%[13,19-20]，且含量与卤虫品系、发育阶段以及饵料相关，随着卤虫的生长，粗蛋白有增加的趋势[18].本研究中哈萨克斯坦和俄罗斯品系卤虫卵粗蛋白差异不显著，约占脱壳卤虫干卵的 50%．除西藏卤虫品系 EPA 含量较高(19.22～46.4mg/g)及含有少量DHA，其他卤虫品系 EPA 含量一般小于 15.4mg/g，而 DHA 普遍缺乏[13-14,21]．本研究中 11个品系卤虫卵(均以干质量计)粗蛋白含量为 49.19%～54.09%，脂肪酸含量为 92.81～144.86mg/g．所有盐湖品系均含有EPA且差异较大，Kuchuk盐湖品系含量较低为0.63mg/g，Jalmantuze盐湖品系含量较高为13.24mg/g．所有品系卤虫卵均不含有 DHA．高度不饱和脂肪酸(highly unsaturated fatty acid，HUFA)，尤其是EPA和DHA，是海水鱼和甲壳类幼苗必需的脂肪酸[14,22]．对于不同品系卤虫卵营养组成差异以及EPA和DHA普遍较低或不存在的状况，可通过营养强化或生物包裹提高卤虫无节幼体的 HUFA含量. 经过 24h强化，n-3HUFA可以达到 50～60mg/g[23-24]. 强化后的卤虫作为饵料投喂水产幼苗，可促进幼苗存活生长和抗病力．

本研究中涉及的哈萨克斯坦和俄罗斯卤虫卵卵径偏大，卵壳厚度有较大差异，说明与卤虫卵径大小无关．温度影响卤虫卵的孵化率和速率，Tike、Halibiekoe和Kuchuk盐湖的卤虫卵在不同温度下孵化率和同步性有较大差异．Tike盐湖卤虫卵适应温度范围较广，孵化同步性均较好，均低于 10h. Hali-biekoe盐湖品系适于较低温度孵化，在 25℃孵化同步性较好，为 8.2h，且该盐湖卤虫卵 EPA 含量较高.Kuchuk盐湖品系适于28℃孵化，同步性为8.6h．