帕布昔利布和氟维司群共载药阳离子脂质体的制备和性质评价

李双双，吕佳琦，李 媛，赵玙璠，滕玉鸥，李明媛,2

(1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.天津市透明质酸应用研究企业重点实验室，天津市康婷生物工程集团有限公司，天津300380)

乳腺癌是全球女性癌症发病率最高的一种恶性肿瘤[1-3].目前，乳腺癌的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、化学治疗、内分泌治疗、靶向治疗及免疫治疗等[4].其中，化学治疗是治疗乳腺癌常用的方法之一.由于单药化疗的使用有限，因此药物联合治疗的方式在临床上应用广泛[5-9].

根据国家综合癌症网络(national comprehensive cancer network，NCCN)的指南，帕布昔利布(palbociclib，Pal)和氟维司群(fulvestrant，Ful)组合被推荐为联合治疗乳腺癌的方案之一[10-11].帕布昔利布能够选择性地抑制细胞周期蛋白依赖性激酶 4和 6(cyclindependent kinase 4/6，CDK4/6)，是一种 CDK4/6抑制剂[12-14].它能恢复细胞周期控制，阻断肿瘤细胞增殖，为美国 FDA批准的首个 CDK4/6抑制剂[15].氟维司群是一种纯粹的雌激素受体(estro-gen receptor，ER)拮抗剂，没有部分雌激素样激动效应，通过结合、阻断并下调 ER，从而抑制雌激素信号通路，能与 ER竞争性结合，与ER的亲和力接近雌激素[16-17].

然而，临床使用中的传统组合只是一种简单混合.由于药物的理化性质、药物代谢动力学性质的不同，简单地将两种药物混合在一起使用具有局限性.为了克服这些局限性，将两种药物共同递送到肿瘤细胞中至关重要.在纳米载体中，脂质体[18-20]具有广阔的应用前景.脂质体是一种具有缓释作用的载体[21]，通过实体瘤的高通透性和滞留效应改善肿瘤组织中的药物积累以及降低药物对正常组织的毒性[22].此外，脂质体的内水相可以包封亲水性药物，脂溶性药物则可包封于磷脂双分子层间，使其可用于亲水和疏水药物的共同递送.帕布昔利布的油水分配系数(logP)为 0.99，具有一定的亲脂性和水溶性，可使用薄膜分散法将其包载于脂质体的磷脂双分子层之间和内水相.氟维司群的 logP为 8.9，为脂溶性药物，被脂质体包载时，可使用薄膜分散法被包载于脂质体的磷脂双分子层之间.阳离子脂质体(cationic liposomes，CLs)是带正电荷的近球形囊泡，主要由阳离子脂质组成，可有效地包载药物.CLs因其表面带有正电荷，可以与带负电荷的细胞膜发生静电作用，进而被细胞膜吸附，促进其被细胞摄取的能力，然后通过细胞内吞或者膜融合方式将药物导入细胞而发挥作用.本研究旨在制备帕布昔利布和氟维司群共载药阳离子脂质体(Pal-Ful-CLs)，通过阳离子脂质体共同递送化学治疗药物帕布昔利布和氟维司群，以提高治疗乳腺癌的疗效.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

帕布昔利布(纯度 99%，批号 HW20E1401-1)，北京华威锐科化工有限公司；氟维司群(纯度≥99%，批号 G01S8Z42903)，上海源叶生物科技有限公司；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，批号 S03005)、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP，批号 001004)，艾伟拓(上海)医药科技有限公司；甲醇为色谱纯，氯仿、二乙胺和磷酸为分析纯，水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯.

UV-2550 PC型紫外分光光度计，美国 Thermo Fisher Scientific公司；PB150Z-S型电子天平，岛津国际贸易有限公司；RE-3000A型旋转蒸发仪、SHI-Ⅲ型循环水式真空泵，上海亚荣生化仪器厂；SB-3200D型超声波清洗仪、SCIENTZ-II D型超声波细胞粉碎机，宁波新芝科技有限公司；TGL-20M 型台式冷冻离心机，湘仪离心机有限公司；1200型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；Model 3100 series型CO2培养箱，赛默飞世尔科技公司；YXQ-LS-50SI型立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司；Nano-ZS90型粒度仪，英国Malvern公司.

1.2 帕布昔利布和氟维司群阳离子脂质体的制备

1.2.1 空白阳离子脂质体的制备

分别称取 DOTAP与 DOPE(物质的量比 1∶3，质量分别为 6.98、22.32mg)混合磷脂于茄形瓶中，加入 3mL有机溶剂(氯仿、甲醇)溶解，37℃减压旋蒸除去有机溶剂，茄形瓶瓶底形成蜂窝状薄膜.常温真空干燥后取下茄形瓶，向茄形瓶中加入2.93mL水化液(DEPC处理水)，50℃水化薄膜，制备为总磷脂质量浓度为 10mg/mL的阳离子脂质体.超声使脂质体粒径均匀，用 0.45µm、0.22µm 无菌滤膜过滤，得到空白脂质体，4℃保存.

1.2.2 载药阳离子脂质体的制备

分别称取 DOTAP与 DOPE(物质的量比 1∶3，质量分别为 6.98、22.32mg)混合磷脂、0.76mmol/L帕布昔利布 1mg、0.56mmol/L氟维司群 1mg于茄形瓶中，加入 3mL有机溶剂(氯仿、甲醇)溶解.按1.2.1节的薄膜分散法制得Pal-Ful-CLs，4℃保存.

1.3 帕布昔利布和氟维司群含量测定方法的建立

1.3.1 紫外吸收全波长扫描

分别称取2mg Pal和2mg Ful标准品于2mL容量瓶中，加流动相定容，分别得 1mg/mL溶液；再稀释至适宜浓度，过滤后待用.取适量样品溶液于石英比色皿中，使用紫外分光光度计进行全波长扫描(波长 190～400nm)[23].

1.3.2 色谱分析与专属性

帕布昔利布色谱条件：色谱柱 Eclipse XDBC18(4.6mm×150mm，5µm)，流动相为乙腈与水(含0.1% 三氟乙酸)，体积比为 25∶75，流量 1mL/min，柱温30℃，检测波长280nm，进样量20µL.

氟维司群色谱条件：色谱柱 Eclipse XDBC18(4.6mm×150mm，5µm)，流动相为甲醇、乙腈和水(含 0.1% 三氟乙酸)，体积比为 70∶7.5∶22.5，流量 1mL/min，柱温 30℃，检测波长 220nm，进样量20µL.

专属性：分别称取10mg帕布昔利布与氟维司群标准品于不同的 10mL容量瓶中，流动相定容、摇匀，分别得 1mg/mL帕布昔利布与氟维司群标准样品储备液，取储备液分别依次稀释定容至 30µg/mL作为对照品.移取空白脂质体破膜后作为空白脂质体供试品，移取 Pal-Ful-CLs破膜后作为共载药脂质体供试品.在色谱条件下检测样品，分析色谱图，记录各样品出峰保留时间.

1.3.3 破膜剂的选择

破膜剂选择能高效破膜且不会对药物测定造成干扰的溶剂.传统脂质体破膜常用甲醇、无水乙醇和5%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液.考察比较了甲醇、无水乙醇和5% SDS溶液破膜的效果.取2mL容量瓶9个，各加入 Pal-Ful-CLs 100µL，再依次加入甲醇、无水乙醇和 5% SDS溶液各 100、200、500µL，旋涡振荡辅助破膜，待无丁达尔效应说明破膜完全.

1.3.4 线性及范围

分别称取 10mg帕布昔利布与氟维司群标准品于不同的 10mL容量瓶中，流动相定容、摇匀，得1mg/mL帕布昔利布与氟维司群标准样品储备液.取储备液依次稀释定容得 500、300、200、100、50、25、10µg/mL的系列标准溶液.在1.3.2节高效液相色谱条件下进样，计算峰面积，绘制峰面积(y)与浓度(x)关系图，得标准曲线.

1.3.5 重复性、精密度与回收率

重复性：分别称取帕布昔利布与氟维司群标准品10mg于不同的 10mL容量瓶中，加流动相定容、摇匀，得 1mg/mL帕布昔利布与氟维司群标准样品储备液.将样品溶液逐级稀释，平行制得 50µg/mL两种样品溶液各6份.在1.3.2节高效液相色谱条件下检测样品，分析记录峰面积，计算相对标准偏差RSD值.

精密度：分别称取Pal和Ful标准品10mg于不同的 10mL容量瓶中，加流动相定容、摇匀，得1mg/mL帕布昔利布与氟维司群标准样品储备液.将样品溶液逐级稀释，各得 50µg/mL样品溶液.在1.3.2节高效液相色谱条件下两种样品各连续进样 6次分析.

回收率：分别精密量取 0.3、0.4、0.5mL Pal储备液于 3个 10mL容量瓶中，接着加入处方比例的空白脂质体，再加500µL乙醇破坏脂质体结构，流动相稀释定容，即为供试品.Ful供试品的制备同 Pal.将上述供试品在1.3.2节高效液相色谱条件下进样分析.

1.3.6 样品稳定性

取Pal-Ful-CLs破膜后于室温下保存，按照1.3.2节色谱条件，于 0、1、2、4、6、8、10、12h 进样测定，计算RSD值.

1.3.7 检测限与定量限

分别称取适量的 Pal和 Ful，用流动相进行倍比稀释，从低浓度到高浓度依次进样，在 1.3.2节色谱条件下测定样品峰面积.当信噪比S/N为3时，进样药物浓度即为样品检测限；当信噪比 S/N为 10时，进样药物浓度即为样品定量限.

1.4 帕布昔利布和氟维司群阳离子脂质体表征

1.4.1 包封率

分别取100µL Pal-Ful-CLs于2个2mL容量瓶中，一份加适量乙醇振荡破坏脂质体结构，流动相定容，利用 1.3.2节高效液相检测方法测定脂质体总药浓度 Cy；另一份直接加去离子水稀释定容，取其500µL置于截留相对分子质量为 3.0×104的超滤器离心管中，以离心力 11180g超滤离心 10min，收集下层滤液，利用 1.3.2节高效液相检测方法测定超滤液中两个游离药物浓度 Cx.分别按式(1)和式(2)计算脂质体包封率和载药量[24-25].

1.4.2 粒径和电位

将脂质体用去离子水稀释适当倍数后制得待测品，在比色皿中加入 1～1.5mL待测品，置于马尔文粒度仪中，在(25±1)℃条件下利用动态光散射技术测定粒径、多分散指数(PDI)和电位.每个样品连续测量3次，计算平均值.

1.4.3 脂质体形态

将 Pal-Ful-CLs适当地稀释后，在铜网上滴加20µL脂质体样品，其中多余的液体用滤纸吸去并自然晾干，在风干处滴加磷钨酸染3s，利用透射电子显微镜(TEM)扫描成像.

2 结果与分析

2.1 帕布昔利布和氟维司群含量测定方法学

2.1.1 紫外全波长扫描

Pal溶液和 Ful溶液紫外全波长扫描图见图1，280nm处为 Pal最大吸收峰，220nm处为 Ful最大吸收峰，故分别选择280nm和220nm为Pal和Ful含量测定的紫外检测波长.

图1 Pal溶液和Ful溶液紫外全波长扫描图Fig.1 Ultraviolet full-wavelength scan of Pal and Ful

2.1.2 破膜实验

由于所制备的脂质体的粒径小于入射光波长(400～700nm)，发生光的散射，这种光的散射现象就称为丁达尔效应.当用一束光照射加入破膜剂后的体系时，出现光路则未破膜或未完全破膜.当 Pal-Ful-CLs中分别加入 100µL、200µL 和 500µL 破膜剂(甲醇、无水乙醇和 5% SDS)后，观察到只有加入500µL无水乙醇后未出现光路，则说明破膜完全，故选择每 100µL脂质体中加入 500µL无水乙醇进行破膜.

2.1.3 专属性

专属性实验结果如图2所示.

图2 Pal和Ful专属性实验结果Fig.2 Specificity test results of Pal and Ful

Pal在9.8min左右出峰，Ful在10.3min左右出峰.在各自的液相条件下两者均能完全分开，互无影响.同时，空白脂质体中的磷脂材料在 9.8min和10.3min左右均不出峰，对于测定无影响.

2.1.4 线性及范围

Pal在 10～500µg/mL的范围内线性良好，线性方程为 y＝57.864x＋66.972，R2＝0.9999，说明拟合度高，符合药典要求.Ful在 10～500µg/mL的范围内线性良好，线性方程为 y＝11.978x＋10.768，R2＝1，说明拟合度高，符合药典要求.

2.1.5 重复性、精密度和回收率实验

在精密度实验中，同一样品连续进样 6次，Pal和Ful峰面积RSD均在2.0%范围内，说明测定方法的精密度好，符合药典要求；在重复性实验中，重复进样6次，Pal和Ful峰面积RSD均在2.0%范围内，说明测定方法的重复性好，符合药典要求；在回收率实验中，Pal和 Ful的回收率均在 98.0%～102.0%的范围内，且RSD均在2.0%范围内，回收率良好.

2.1.6 样品稳定性

测定 Pal-Ful-CLs破膜后 12h内峰面积，Pal和Ful的 RSD值分别为 1.83%和 1.73%，均在 2.0%范围内，样品稳定性良好.

2.1.7 检测限与定量限

Pal检测限为 25ng，定量限为 30ng；Ful检测限为500ng，定量限为1µg.

2.2 脂质体性质评价

超滤离心法测得Pal和Ful脂质体的包封率分别为 31.20%和 100.00%.由于 Pal的 logP为 0.99，在0～3之间，具有脂溶性和水溶性，其与磷脂之间的相互作用弱，容易渗漏，导致包封率低.因此，在后续的实验中，考虑制备较高浓度的脂质体，用以增加内水相体积所占比率，从而提高其包封率.而Ful的logP为 8.9，具有强亲脂性，与磷脂具有强烈的相互作用，使脂质体不易渗漏，因此包封率高.图3为阳离子脂质体的粒径和电位分布图.Pal-Ful-CLs的平均粒径为(182.13±3.56)nm，多分散系数为0.18±0.02(小于0.2)，表明分散度良好.Pal-Ful-CLs的电位为(57.1±2.6)mV，阳离子脂质体表面的正电荷有利于脂质体在体系中的分散均匀和稳定.

图3 脂质体的粒径和Zeta电位分布Fig.3 Particle size and Zeta potential distribution of liosomes

2.3 TEM表征脂质体形态

通过透射电镜观察脂质体形态(图4)可见，Pal-Ful-CLs呈圆形且均匀分散，粒径与粒度仪所测一致.

图4 Pal-Ful-CLs的透射电镜图Fig.4 TEM image of Pal-Ful-CLs morphological study

3 讨 论

药物的联合使用已经在癌症治疗中引起了广泛关注，耐药性和肿瘤复发通常与基于单一药物的癌症化学疗法相关.乳腺癌是发生于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，属于激素依赖性肿瘤.若患者 ER属阳性，则可为患者实施内分泌辅助治疗.Ful属于新型雌激素受体下调剂，具有很好的临床效果[26].内分泌疗法的作用机制可能与抑制 CDK4/6的活性部分相关，CDK4/6活化可能导致内分泌治疗耐药，抑制CDK4/6活性的药物与内分泌治疗药物联用可能会起协同作用[27].因此，Ful和 Pal的联合使用可以提高治疗乳腺癌的疗效.然而，通过将两种药物简单混合的方法控制肿瘤细胞的药物比例和剂量具有挑战性.本研究制备了一种阳离子脂质体，能够同时包载Ful和 Pal并共同递送至肿瘤细胞，并对其性质进行了评估.

本研究首先使用紫外全波长扫描测定了 Pal和Ful的最大吸收峰，根据紫外全波长扫描图选择280nm和220nm为Pal和Ful含量测定的紫外检测波长.在使用高效液相色谱法测定前，需要对脂质体进行破膜实验，本研究分别用甲醇、无水乙醇和 5%SDS作为破膜剂，根据有无光路选择以每 100µL脂质体中加入 500µL无水乙醇进行破膜.超滤离心法测得 Pal和 Ful脂质体的包封率分别为 31.20%和100.00%.由于 Pal的包封率较低，在后续的实验中，考虑制备较高浓度的脂质体，用以增加内水相体积所占比率，用以提高其包封率.Pal-Ful-CLs的平均粒径为(182.13±3.56)nm，多分散系数为 0.18±0.02，表明分散度良好；Pal-Ful-CLs的电位为(57.1±2.6)mV，使脂质体通过静电斥力稳定分散，同时阳离子脂质体表面正电荷可以与带负电荷的核酸药物通过静电吸附作用结合.因此，将化疗药物和核酸药物进行同时包载用于癌症治疗是下一步实验研究的重要内容.本研究制备的共载药阳离子脂质体粒径均一、分散稳定并且工艺重现性好，作为药物共同递送载体具有一定的应用前景.