苎麻expansin 家族成员鉴定与表达分析

石亚亮，钟意成，黄坤勇，牛娟，孙志民，陈建华∗，栾明宝∗

(1.三亚中国农业科学院国家南繁研究院，海南 三亚 572024；2.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410221)

扩展蛋白最早被鉴定为一种具有细胞壁松弛作用的蛋白，部分介导了植物细胞壁延伸和细胞生长。 扩展蛋白主要分为两个蛋白家族，即α 和β 扩展蛋白亚族，他们不仅作用于细胞膨胀，还参与调节包括形态发生、果实软化、花粉管生长等多种植物生长过程[1]。 蛋白功能被细胞壁酸性条件激活，在植物中存在一些反应机制会诱导细胞壁pH 值发生变化而影响细胞的生长[2]。 由于扩展蛋白对细胞壁具有独特的修饰作用，先后在棉花和苎麻关于纤维发育的研究中得到关注，已有研究发现3 种编码扩展蛋白的基因在苎麻的上部茎皮上调表达[3－4]。 一些家族成员基因在其他植物中的功能相继被证实，涉及促进生长、改善纤维品质和盐胁迫响应，例如水稻OsEXP4[5]、棉花GhEXPA8[6]和GbEXPATR[7]、小麦OsEXPB23[8]等。 扩展蛋白在苎麻中的研究才刚刚起步，该家族基因具体的分子功能及其对纤维细胞的发育和纤维品质的影响尚不清楚。

在Swiss－Prot 数据库中:水稻的56 个编码扩展蛋白的基因，包括α 亚族34 个，β 亚族19 个；拟南芥36 个编码扩展蛋白的基因包括α 亚族25 个和β 亚族7 个；玉米4 个基因都属于β 亚族。苎麻中通过转录组序列拼接和同源基因克隆的方法发现了12 个α 亚族和4 个β 亚族，共16 个编码扩展蛋白的基因[9]。 然而，目前还未对苎麻expansin家族成员的具体数目和类型进行全面鉴定。苎麻基因组测序草图的顺利完成[10]，使利用生物信息学在全基因组水平上分离和鉴定expansin家族成为可能。 因此，本研究利用苎麻基因组数据库对苎麻expansin家族成员及其类型进一步鉴定与分析，旨在为苎麻纤维发育候选基因挖掘奠定基础。

1 材料与方法

1.1 苎麻expansin 家族成员鉴定

在Pfam 数据库下载扩展基因家族保守结构域数据文件(登录号分别为PF03330 和PF01357)，利用hmmer v3.0 软件构建苎麻expansin家族专有的保守结构域隐马尔可夫模型文件，然后在苎麻基因组蛋白数据中搜索家族成员[11]。 将家族蛋白氨基酸序列在HMMER 网站(https:/ /www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer)进行序列分析。

1.2 理化性质分析和亚细胞定位

通过ExPASy 网站(https:/ /www.expasy.org/)中的Protparam 程序分析蛋白质的分子量、等电点，利用Signal P－5.0 预测蛋白的信号肽，采用pLoc－mPlant 进行蛋白的亚细胞定位预测。

1.3 扩展基因结构及蛋白序列分析

利用在线软件MEME(http:/ /meme－suite.org/)对扩展蛋白保守结构域进行分析。 最大motif数量设为20，其他参数为默认值。 根据苎麻基因组的DNA 序列和编码区序列，使用TBtools 软件[12]分析和绘制基因家族成员的基因结构图。

1.4 基因家族系统进化分析

利用分子进化分析软件MEGA7 的ClustalW 程序对鉴定的苎麻扩展蛋白氨基酸序列进行多重序列比对，采用邻接法(NJ，neighbor－joining)构建系统发育树。 在Swiss－Prot 数据库下载水稻和拟南芥的expansin家族的蛋白氨基酸序列，与苎麻的蛋白氨基酸序列进行比对，默认参数，bootstrap值设为500，构建NJ 进化树。

1.5 表达分析

依据本课题组已经完成的苎麻转录组测序结果，即2 个纤维细度差异大的品种，编号为2－25(纤维细度1312 m/g)和3－4(2788 m/g)，发芽2 周(T1)、4 周(T2)、6 周(T3)、8 周(T4)、10 周(T5)5 个不同纤维发育时期茎皮中各基因的FPKM 值[13－14]，分析其5 个发育时期的expansin家族基因表达模式。 利用与转录组相同的样品材料(液氮冷冻，－80 ℃保存)，提取苎麻茎皮总RNA，RNA 提取方法和模板cDNA 的合成均按照试剂盒操作手册。 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 用于茎皮总RNA 提取，Thermo Scientific RevertAid first－strand cDNA synthesis kit (Thermo Scientific， Vilnius， Lithuania)用于cDNA 合成，合成20 μL 体系cDNA，用ddH2O 稀释一倍后备用。 根据扩展蛋白基因家族表达差异的结果在Primer 5 设计相关基因的特异性引物，以苎麻18S rRNA为内参基因， 于Bio－Rad iQ5 Real－Time PCR System (Bio－Rad， CA， USA)分析仪上进行qRT－PCR 分析，25 μL qPCR 体系，即1 μL cDNA，12.5 μL 2×SYBR qPCR Mix (北京艾德莱生物公司)， 各1 μL 上下游引物(10 μmol/L)和10.5 μL ddH2O， 程序为95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s和55 ℃30 s，40 个循环，每个样品设3 个重复，并按照2－ΔΔCT的方法计算基因的相对表达量[15]。利用GraphPad Prism 8 软件的Holm－Sidak 方法对表达量进行t测验，以比较基因在品种间和时期间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 基因家族成员的鉴定及理化性质分析

通过全基因组基因家族成员挖掘，去掉结构和功能冗余的2 个候选序列，共获得了27 个expansin基因候选序列。 在Pfam 数据库对这些序列进行结构域注释，发现24 个具有家族保守结构域的DPBB＿1 和Pollen＿allerg＿1，3 个缺失第二个结构域的候选序列。 对此24 个具有完整结构域基因的命名沿用苎麻基因组蛋白数据库注释。

比较和分析24 个苎麻扩展蛋白序列的理化性质(表1)，氨基酸数目213aa(Expansin－A23)～589aa(Expansin－B15＿3)，分子量23 253.44 Da(Expansin－A23)～62 928.18 Da(Expansin－B15＿3)，等电点4.78(Expansin－like＿2)～9.96(Expansin－A12＿1)。 预测发现5 个蛋白序列没有信号肽，分别为Expansin－A23、Expansin－A12＿2、Expansin－A4＿1、Expansin－B15＿3、Expansin－A12＿1。 亚细胞定位结果显示24 个苎麻扩展蛋白均位于细胞壁。

表1 苎麻扩展蛋白基本理化性质Table 1 Physical and chemical characteristics of ramie expansins

续表1

2.2 基因家族的基因结构及蛋白质基序预测

苎麻expansin家族成员外显子数目为2～9 个，内含子数目为1～8 个。 根据MEME 分析结果，选择其中E－value 最低为8.4e－003 的17 个保守基序作图(图1)。 同一进化支蛋白的结构域均保守且每个基因亚族蛋白含特有的保守基序(motif)，α 亚族蛋白特有motif 3，β 亚族特有motif 8，EXPL 支(EXPLA亚族和EXPLB亚族)特有motif 15。

图1 扩展家族蛋白序列保守基序和基因结构与3 个特有保守基序Fig.1 Protein sequence conserved motifs and gene structure of expansin family and 3 specific motifs

2.3 苎麻expansin 家族的系统进化分析

在Swiss－Prot 数据库下载水稻和拟南芥的expansin家族的蛋白氨基酸序列，分别为36 和56条，与24 条苎麻蛋白氨基酸序列一起构建进化树(图2)。expansin家族包括EXPA、EXPB、EXPLA、EXPLB等4 个亚族，在进化树中可分为EXPA、EXPB、EXPL 3 大类。 EXPA 类包含苎麻expansin家族的17 个基因(α 亚族)，EXPB 类包含4 个基因(β 亚族)，EXPL 类有3 个基因(1 个α 类亚族和2个β 类亚族)。

图2 苎麻expansin 家族进化树Fig.2 Expansin family phylogenetic tree in ramie

2.4 基因家族成员的表达分析

5 个发育时期的expansin家族基因表达模式如图3 所示，9 个基因在两个品种间存在明显的差异表达情况，其中BnEXPA16、BnEXP－like－3 和BnEXPA20 仅在品种3－4 的T3、T4 及T5 期上调表达，BnEXP－like－1 和BnEXPA7 仅在品种2－25 的T4 期上调表达，BnEXPA8－2、BnEXPB3、BnEXPA23 和BnEXPA11 仅在品种2－25 的T2 期上调表达。 两个苎麻品种5 个生长期内，在T1 和T2 期都上调表达的有BnEXPA2－1、BnEXPA2－2、BnEXP－like－2、BnEXPA8－1、BnEXPA12－1、BnEXPA8－2、BnEXPA1、BnEXPA15、BnEXPA4－1、BnEXPA13。 在T3、T4 和T5 期都上调表达的有BnEXPB15－1、BnEXPB15－2 和BnEXPB15－3。

图3 苎麻expansin 家族基因表达量热图Fig.3 Gene expression heatmap of expansin family in ramie

根据转录组数据分析结果和相关差异表达基因的功能分析，选择BnEXP－like－3 和BnEXPB15－2 这两个基因做进一步分析(特异性引物序列见表2)，荧光定量PCR 结果(图4)显示，5 个时期苎麻茎皮中两个基因的表达量呈现显著差异(p<0.01)，两个基因在品种3－4 表达量明显高于2－25 的表达量。

表2 expansin 家族基因特异qRT－PCR 引物(5’→3’)Table 2 Expansin family genes specific qRT－PCR primers (5’→3’)

图4 BnEXP－like－3(左)和BnEXPB15－2(右)在两个苎麻品种茎皮5 个时期的相对表达量Fig.4 Expression level of BnEXP－like－3(left) and BnEXPB15－2(right) of stem bark at five growth stages of 2 varieties

3 讨论与结论

苎麻中鉴定出的4 种扩展蛋白亚族的蛋白，包括α 亚族17 个、β 亚族4 个、α 类亚族1 个和β类亚族2 个。 蛋白质的氨基酸序列分析表明，可依据其特有的保守基序区分不同亚族的扩展蛋白，苎麻expansin家族α 亚族蛋白特有motif 3，β 亚族特有motif 8， α 类亚族和β 类亚族共特有motif 15。 表达分析结果显示，expansin家族成员在不同品种和时期存在表达差异，且BnEXP－like－3 与BnEXPB15－2 两个基因在品种3－4 中各个时期的相对表达量均高于2－25。 目前被报道与纤维发育相关的扩展蛋白基本属于如EXP1、EXPA2、EXPA8 等所在的成员数量占有优势的α 亚族[3－4，6－7]，而鲜有α 类亚族和β 亚族的成员。 另外，有研究发现，苎麻纤维细度还受光照、湿度、温度等生态环境因素的影响[16]。 本研究首次发现在两个在纤维细度不同的两个品种间呈表达差异的BnEXP－like－3 与BnEXPB15－2，其所在亚族的蛋白被报道与植物抗逆性相关，如启动子序列存在脱落酸、生长素、水杨酸等激素诱导元件和对干旱、高温等非生物胁迫的响应元件的OfEXLA1[17]，及被证实由磷酸盐饥饿诱导且能够提高大豆磷效率的GmEXPB2[18]。 因此，BnEXP－like－3和BnEXPB15－2 是否具有通过对苎麻生长环境响应而影响纤维细度的功能值得深入探讨。

棉花中发现了两个扩展蛋白基因，GbEXPA2 通过增加结晶纤维素含量影响纤维细胞厚度，GbEXPATR是编码一个缺失Pollen＿allerg＿1 结构域的蛋白基因，同属于扩展蛋白α 亚族，过表达GbEXPATR纤维会产生更长、更结实的薄壁纤维[7]。 在本研究中也发现了3 个缺失第二结构域的蛋白，其中两个有信号肽，但与扩展蛋白家族各个亚族的蛋白相似性不高，其功能有待进一步研究。