工业大麻花提取物对3 种植物病原真菌的抑菌活性

朱春晖，程菊娥，周英，解啸，黄妃兰，孙书娥，张德咏

(1.湖南省农业科学院植物保护研究所，湖南 长沙 410125；2.西双版纳傣族自治州农业科学研究所，云南 景洪 666100)

工业大麻是大麻科(Cannabinaceae)大麻属(Cannabis)一年生草本植物，是指四氢大麻酚含量低于0.3%的大麻，其植株的化学成分复杂，含有多酚类、黄酮类、生物碱类、萜类等大量活性物质，具有一定的抗菌性[1]。 目前工业大麻的抗菌作用研究主要是针对大肠杆菌、金色葡萄球菌等细菌的拮抗作用[2－4]，针对真菌特别是植物病原真菌的研究甚少。 杨帆等[5]的研究表明，工业大麻植株的花提取物对大豆疫霉病菌、小麦赤霉病菌和玉米小斑病菌抑制活性比较好。 辣椒白绢病是由齐整小核菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)侵染所引起的辣椒土传病害，主要危害茎基部和根部[6]。 辣椒炭疽病是由刺盘孢属和长圆盘孢属侵染所引起的，为发生在辣椒上的病害[7]。 本研究选取的是辣椒刺盘孢菌(Colletotrichum capsici(syd. )Butl.)。 稻瘟病是一类重要的作物病害，可引起水稻大幅度减产，病原菌为稻梨孢(Pyricularia oryzaeCav.)，属半知菌亚门真菌[8]。 本研究选取3 个工业大麻品种云麻7 号、云麻8 号、云麻10 号的雌雄花，采用乙醇溶液进行提取，分别测试提取液对辣椒白绢病菌、辣椒炭疽病菌和稻瘟病菌菌丝生长的抑制率，探讨工业大麻花提取物对植物病原真菌的抑制效果。

1 材料与方法

1.1 材料

云麻7 号、云麻8 号和云麻10 号的雌花和雄花，均由云南省西双版纳傣族自治州农业科学研究所在勐海试验基地采集提供，雄花在始花期采收，雌花在盛蕾期采收，采集时均在距顶部15～20 cm处截断，采集后晒干备用；

试验中所用乙醇为95%乙醇；

供试植物病原菌:辣椒白绢病菌、辣椒炭疽病菌、稻瘟病菌，由湖南省植物保护研究所实验室分离保存。

1.2 研究方法

1.2.1 工业大麻雌花和雄花活性物质的提取

将采集的云麻7 号、云麻8 号、云麻10 号的雌雄花样品晒干、粉碎，每份样品各称取100 g，分别加入500 mL 95%的乙醇溶液，冷浸(0 ℃)24 h，离心(3000 r/min，5 min，4 ℃)，真空抽滤，滤渣重复提取3 次，合并滤液，减压蒸馏(45 ℃)，得到云麻7 号、云麻8 号、云麻10 号的雌雄花提取物，避光冷藏备用(4 ℃)。

1.2.2 工业大麻花提取物对3 种植物病原菌的抑菌活性测定

工业大麻花提取物对植物病原菌的活性测定采用菌丝生长速率法。 将工业大麻花提取物分别加入95%的乙醇溶液，配置成不同质量浓度的供试液，浓度由低到高分别为50、100、200、400、800 mg/mL。 分别取1 mL，加入50 mL 温度为45 ℃的PDA 培养基中，摇匀，平均倒入3 个直径为9 cm的灭菌培养皿中，冷却后即制得终浓度分别为1、2、4、8、16 mg/mL 的培养基平板。 在无菌条件下，将培养好的病原菌分别接入直径10 mm 的供试菌饼，每个菌种设3 皿重复。 以每50 mL 培养基中加入1 mL 95%乙醇溶剂的培养基平板作为空白对照，恒温(25 ℃)培养7～10 d，待对照平板长满后，采用十字交叉法量取菌落圈直径，并取其平均值作为处理菌落直径，计算抑制率，运用DPS 7.05 软件对数据进行统计分析，并采用Duncan 新复极差法对抑制率进行差异性检验。

根据浓度和抑制率数据，采用DPS 7.05 统计软件求毒力回归方程和相关系数，计算有效中浓度EC50值。

2 结果与分析

2.1 工业大麻花提取物对3 种植物病原真菌的抑制效果

工业大麻花提取物对3 种植物病原真菌的抑制效果见表1～3。

表1 工业大麻花提取物对辣椒白绢病菌抑制效果Table 1 Inhibitory effect of industrial hemp flower extracts on pepper sclerotium blight(Sclerotium rolfsii Sacc.)

表2 工业大麻花提取物对辣椒炭疽病菌抑制效果Table 2 Inhibitory effect of industrial hemp flower extracts on pepper anthracnose (Colletotrichum capsici (syd.) Butl.)

表3 工业大麻花提取物对稻瘟病菌抑制效果Table 3 Inhibitory effect of industrial hemp flower extracts on rice blast (Pyricularia orzyae Cav.)

从表1 可以看出，辣椒白绢病菌的抑制率随着工业大麻花提取物浓度的升高而升高。 当浓度为1 mg/mL 时，云麻8 号雌花和雄花提取物对辣椒白绢病菌抑制率最低，均为18.04%；浓度为16 mg/mL时，云麻7 号雄花提取物对辣椒白绢病抑制率最高，为91.37%。

从表2 可以看出，辣椒炭疽病菌的抑制率随着工业大麻花提取物浓度的升高而升高。 浓度为1 mg/mL时，云麻10 号雄花提取物对辣椒炭疽病菌抑制率最低，为11.76%；浓度为16 mg/mL 时，云麻7 号雌花提取物对辣椒炭疽病菌抑制率最高，为81.96%。

从表3 可以看出，稻瘟病菌的抑制率随着工业大麻花提取物浓度的升高而升高。 浓度为1 mg/mL时，云麻10 号雄花提取物对稻瘟病菌抑制率最低，为14.12%；浓度为16 mg/mL 时，云麻10 号雌花提取物对稻瘟病菌抑制率最高，为76.86%。 综上所述，3 个不同品种的工业大麻花提取物对3 种不同植物病原真菌的抑制浓度具有一定差异，3 种植物病原真菌的抑制率随着工业大麻花提取物浓度的升高而升高。 辣椒白绢病菌各个浓度的抑制率整体要低于辣椒炭疽病菌和稻瘟病菌的。 辣椒炭疽病菌和稻瘟病菌相同浓度下抑制率相互间差异较小。

2.2 工业大麻花提取物对3 种植物病原真菌的抑菌毒力

工业大麻花提取物对3 种植物病原真菌的抑菌毒力统计结果见表4～6。 由表4 可以看出，6种工业大麻花提取物对辣椒白绢病菌的抑菌毒力存在差异:云麻7 号雄花提取物对辣椒白绢病抑制浓度最低，EC50值为4.660 1 mg/mL；而云麻8 号雄花提取物对辣椒白绢病抑制浓度最高，EC50值达到了32.377 0 mg/mL。

表4 工业大麻花提取物对辣椒白绢病菌的抑菌毒力Table 4 Bacteriostatic toxicity of industrial hemp flower extracts against pepper sclerotium blight (Sclerotium rolfsii Sacc.)

表5 工业大麻花提取物对辣椒炭疽病菌的抑菌毒力Table 5 Bacteriostatic toxicity of industrial hemp flower extractst against pepper anthracnose(Colletotrichum capsici (syd.) Butl.)

表6 工业大麻花提取物对稻瘟病菌的抑菌毒力Table 6 Bacteriostatic toxicity of industrial hemp flower extracts against rice blast(Pyricularia orzyae Cav.)

由表5 可以看出，6 种工业大麻花提取物对辣椒炭疽病菌的抑菌毒力有差异:云麻7 号雌花提取物对辣椒炭疽病菌抑制浓度最低，EC50值为3.114 9 mg/mL；而云麻7 号雄花提取物对辣椒炭疽病菌抑制浓度最高，EC50值达到了6.513 5 mg/mL。

由表6 可以看出，6 种工业大麻花提取物对稻瘟病菌的抑菌毒力有差异:云麻7 号雌花提取物对稻瘟病菌抑制浓度最低，EC50值为4.631 0 mg/mL；而云麻8 号雄花提取物对稻瘟病菌抑制浓度最高，EC50值达到了8.252 0 mg/mL。

3 讨论与结论

现有研究表明，工业大麻提取物对大豆胞囊线虫、南方根结线虫、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、李斯特菌和沙门氏菌等都有抑制效果[9－14]，另有报道在工业大麻提取物中发现具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡且表现出广谱抗肿瘤作用的化合物[15]。 本研究选取具有代表性的3 种植物病原真菌作为研究对象，检测工业大麻花提取物对植物病原真菌的抑菌效果。

研究表明[12，14，16]，工业大麻叶提取物对金黄色葡萄球菌和李斯特菌的最低抑菌浓度分别为7.81、15.63 mg/mL，对大肠杆菌的最低抑菌浓度为6.25 mg/mL。 本研究选取的工业大麻花提取物最低浓度为1 mg/mL 时均有抑菌效果，其中浓度为1 mg/mL 时对辣椒炭疽病菌的最低抑制率是云麻10 号雄花提取物的11.76%，对辣椒白绢病菌的最高抑制率是云麻10 号雄花提取物的37.25%。

杨帆等[5]采用溶剂浸提法提取的工业大麻花、叶、茎和根4 种不同器官的粗提物，对大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)和玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)3 种病原物均具有一定的抑菌活性，其中工业大麻花的提取物对小麦赤霉病菌的抑制活性最佳，抑制率可达50%。 因此本研究选取工业大麻花提取物作为研究对象，雌花和雄花分别提取，比较雌花、雄花提取物的抑菌活性差异。 本研究工业大麻花提取物浓度达到16 mg/mL 时，对3 种植物病原真菌的抑菌率均接近或超过50%，抑菌活性更高。

张正海等[2，4，16]研究发现，工业大麻提取物成分Fr5 馏分(石油醚和乙酸乙酯1∶1 提取后的馏分5)破坏金黄色葡萄球菌、李斯特菌的细胞壁和细胞膜结构，导致细胞膜通透性增加，内容物和电解质外泄，进而影响菌体能量代谢并造成质膜氧化损伤，抑制细胞生长，最终使细菌生长受到抑制。 本研究发现工业大麻花提取物对3 种植物病原真菌均有抑制作用，为植物源真菌杀菌剂的应用提供了参考。 但是本研究中工业大麻花提取物对植物病原真菌起抑制作用的具体成分及抑菌机理尚不清楚，有待下一步深入研究。