大麻叶中总黄酮提取工艺的优化及其抗氧化活性测定

刘毅，冷鹃，刘亮亮，肖爱平

（中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙410205）

大麻（CannabissativaL.），别名汉麻、线麻、火麻等，是大麻科大麻属一年生草本植物，包括纤维用大麻、药用大麻、野生大麻等3类［1］。大麻用途很多，可以提供纤维、纤维素、种子和种子油、大麻醇类物质，以及生物质材料，此外还可作为研究特殊代谢途径的模式植物，具有很大的开发价值［2］。大麻还具有药用价值，根茎叶均可入药，大麻花主治记忆力衰退；大麻籽主治便秘、消渴、血痢不止、发落不生等；大麻茎或茎皮主治破血、跌打损伤等［3］。我国是世界上最主要的大麻生产国，南起云南，北达黑龙江都有大麻种植，大麻在我国主要用作纺织原料［4］。大麻的叶、花、茎中有62种化合物，包括黄酮及其苷类化合物、生物碱类化合物、香豆素类化合物、萜类及甾醇类化合物、脂肪酸类化合物、菲类化合物及其他化合物［5］，其中黄酮为极具研究价值的活性物质。

黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基［6］、抗突变、抗衰老、抗菌［7］、抗肿瘤［8］等生物活性，有强心、扩张冠状动脉、降血压、降血脂、祛痰、镇咳、平喘以及减少糖醇堆积、利于白内障防治等药用功效［9］。在抗氧化作用上，黄酮表现为对单线态氧及含氧自由基的清除能力，其中，单线态氧以及生物系统中产生的自由基如超氧化物自由基和羟基自由基均可诱导脂质过氧化反应，损伤细胞［10］。目前黄酮类化合物的提取方法包括水提法、有机溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法、酶解法、大孔树脂吸附法和超滤法等［11］。在黄秋葵［12］、金雀花［13］、苦参［14］、枇杷［15］、半枝莲［16］、薄荷［17］、水芹［18］等植物中，对黄酮提取工艺及抗氧化性研究均有报道。大麻中黄酮提取纯化工艺的研究已有报道［19］，而对其抗氧化能力的研究还未见报道。黄酮类化合物多数以甙的形式存在，少数以游离形式存在，是一种很强的活性氧自由基清除剂，已广泛应用于医药领域［20］。不同植物中黄酮提取的最佳条件及抗氧化能力存在差异：在沙棘中，确定最佳提取条件为乙醇体积分数60&、提取时间 40 min、料液比1∶50（g／mL）；在黄秋葵中，最佳提取工艺为料液比1∶25（g／mL）、提取时间2 min、提取温度75℃、乙醇体积分数50&，沙棘果渣黄酮和黄秋葵黄酮提取液对羟自由基和超氧阴离子自由基均有一定的清除作用，表现出较好的体外抗氧化活性［21］。

本试验以大麻叶片为试验材料，探究回流法提取大麻叶片总黄酮的工艺条件，即以总黄酮浸提量为评价指标，运用单因素试验考察乙醇体积分数、提取时间、料液比、提取温度对黄酮提取效率的影响，在单因素试验基础上通过响应面分析法优化总黄酮提取工艺；通过FRAP法、ABTS法、DPPH自由基清除能力等测定黄酮的总抗氧化能力，评价大麻叶总黄酮的体外抗氧化活性，旨在为大麻叶总黄酮的开发利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大麻叶：“大麻2号”顶部向下8～12片成熟叶，随机采集于中国农业科学院麻类研究所麻类种质资源圃。采集叶片后，于烘箱中45℃干燥充分，粉碎得到大麻叶粉末，供后续试验用。

芦丁标准品（上海源叶生物科技有限公司，分析纯）、乙醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）、甲醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）、乙酸钾（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）、六水合三氯化铝（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）。

FRAP试剂盒（南京建成有限公司）、DPPH试剂盒（南京建成有限公司）、ABTS试剂盒（南京建成有限公司）。

1.2 仪器与设备

PB602-L电子天平（梅特勒-托利多国际有限公司）、KY15-19粉碎机（天津美斯特有限公司）、UV-2700紫外可见分光光度计（岛津企业管理有限公司）、EV351旋转蒸发仪（北京莱伯泰仪器股份有限公司）、BPG-9140A风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、KQ-5200DV超声波清洗器（昆山市仪器超声有限公司）、WEB-6多孔水浴锅（DAIHAN Scientific Co，Ltd）。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制

准确称取芦丁标准样品20 mg，加甲醇溶解并定容到100 mL，得到0.2 mg／mL的芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得到0.005、0.010、0.020、0.040、0.060、0.080mg／mL的标准品梯度溶液，各取1mL到试管中，加入2 mL 0.10 mol／L三氯化铝溶液，摇匀，静置6 min，再加入3 mL 1 mol／L乙酸钾溶液，摇匀后静置6 min，再用甲醇（甲醇∶水（V∶V）＝70∶30）溶液定容到10 mL，静置15 min后，于420 nm波长下测定吸光度。绘制标准曲线。

1.3.2 总黄酮含量测定

准确称取大麻叶粉末3批，每批2 g，分别加入乙醇溶液后在一定温度下回流提取，将提取液过滤，然后用乙醇溶液定容到100 mL。取提取液1 mL至10 mL比色管中，各加入2 mL 0.10 mol／L三氯化铝溶液摇匀，静置6 min，再加入3 mL 1 mol／L乙酸钾溶液，摇匀，静置6 min，再加入甲醇溶液（甲醇∶水（V∶V）＝70∶30）定容至刻度，放置15 min。样品空白不加显色剂，分别在420 nm波长处测定其吸光度，保证吸光值在线性范围内。代入标准曲线回归方程计算浓度数据C（mg／mL）（以芦丁为参比），3次结果取平均值。按公式（1）计算总黄酮浸提量。

式中：X—测出的浓度，mg／mL；

n—稀释倍数，量纲为1；

V—测定时取样体积，mL；

W—样品质量，g。

1.3.3 单因素试验

分别以提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h），乙醇体积分数（50&、60&、70&、80&、90&、100&），料液比（g／mL）（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30），提取温度（50、60、70、80、90℃），提取次数（1、2、3、4次）为单因素，考察其对总黄酮浸提量的影响。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 8.0软件进行响应面优化设计［22］。根据单因素试验结果，选取料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度为影响因素，以总黄酮浸提量为评价指标，提取2次，设计四因素三水平响应面分析试验，中心试验重复4次，共29个试验点［23］。试验因素水平如表1所示。

表1 响应面分析因素与水平编码值Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.5 FRAP法测定总抗氧化能力

参照试剂盒的FRAP法测定总黄酮的总抗氧化能力。总抗氧化能力用FeSO4标准液的浓度表示。FRAP工作液按照检测缓冲液、基质液与底物液体体积比为10∶1∶1配置，充分混合避光37℃孵育，现配现用，1～2 h内用完。标准品 FeSO4·7H2O溶液设置 0.10、0.20、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol／L 6个浓度梯度，各取5μL与180μL FRAP工作液反应后测定A593，以标准品溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。样品检测取5μL，设置3次重复，测定吸光度后根据标准曲线计算其总抗氧化能力（以FeSO4.7H2O为参比）。

1.3.6 ABTS快速法测定总抗氧化能力

参考T-AOC试剂盒（ABTS快速法）测定总黄酮总抗氧化能力，用相对Trolox总抗氧化能力表示。Trolox标准品设置0.1、0.2、0.3、0.4、0.8、1.0 mmol／L 6个浓度梯度，与过氧化物酶工作液、ABTS工作液反应后在414 nm波长下测吸光度，绘制标准曲线。样品测定组为稀释的黄酮提取液与过氧化酶工作液、ABTS工作液反应，反应相同时间后测吸光值A414，根据标准曲线计算总黄酮相对于Trolox的总抗氧化能力（以Troxlox为参比）。

1.3.7 DPPH自由基清除能力测定

取1mg DPPH溶解于20mL的甲醇，超声5 min，配制成DPPH溶液。取DPPH溶液2mL加入5个试管中，依次加入样品液20、40、60、80、120μL，加入相应体积的无水乙醇定容到3 mL，混合反应5 min后，在519 nm波长处测得吸光值A1；空白对照组用2 mL无水乙醇代替DPPH溶液［24-25］，反应相同时间后，测定519 nm波长下吸光值A0。此外，抗坏血酸（VC）作阳性对照。DPPH自由基清除率按式 （2）计算。

假设样品的最大抑制率是100&，此时A1＝A2；最小抑制率是0，此时A2-A1＝A0，

式中：A0—空白吸光度；

A1—样品吸光度；

A2—最小吸光度。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以吸光度（A）为纵坐标，芦丁质量浓度（C，mg／mL）为横坐标绘制芦丁标准曲线，如图1所示。标准曲线回归方程为Y＝31．35x-0．0114，R2＝0．994，相关性良好，线性范围 0.05～0.08 mg／mL。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取时间对大麻叶总黄酮浸提量的影响

以1∶15（g／mL）料液比加入无水乙醇，在70℃的水浴锅中回流提取1次，测定不同提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对总黄酮浸提量的影响。由图2可知，在提取时间1～2 h内，随着提取时间的增加，总黄酮浸提量也随之增加，而在2 h后出现降低趋势，2.5 h后缓慢增加。这是由于提取时间会影响大麻叶细胞壁的破坏程度，随着提取时间增长，细胞壁破坏更加充分，更多黄酮得以释放，达到阈值后，提取时间过长，黄酮可能被破坏［16］。因此，提取时间优选为2.0 h。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

图2 提取时间对大麻叶总黄酮浸提量的影响Fig.2 The effect of extraction time on the yield of flavonoids from hemp leaves

2.2.2 乙醇体积分数对大麻叶总黄酮浸提量的影响

以1∶15（g／mL）料液比加入不同体积分数乙醇（50&、60&、70&、80&、90&、100&），在70℃水浴锅中提取2.0 h，提取1次，测定乙醇体积分数对大麻叶总黄酮浸提量的影响。由图3可知，乙醇体积分数为80&时，总黄酮浸提量最大。当乙醇体积分数在50&～80&时，总黄酮浸提量随乙醇体积分数的增加而增加，而乙醇体积分数超过80&后则有所降低。乙醇可影响叶片细胞穿透能力，从而改变黄酮提取效率，此外，乙醇体积分数过高，可能导致其他醇溶性物质被提出，而总黄酮溶出较少［26］。

2.2.3 料液比对大麻叶总黄酮浸提量的影响

以不同料液比 （g／mL）（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）加入 80&乙醇，在 70℃水浴锅中提取2.0 h，提取1次，测定料液比对大麻叶总黄酮浸提量的影响。由图4可知，随着浸提液用量的增加，总黄酮浸提量总体上有增大趋势，当料液比为1∶25（g／mL）时总黄酮浸提量达到最大，之后则随着浸提液用量的增加，总黄酮浸提量减小。浸提液用量增加，黄酮物质溶解析出增加，但达到阈值后，提取量减少，此外，提取成本也增加。因此1∶25（g／mL）为最优料液比。

图3 乙醇体积分数对大麻叶总黄酮浸提量的影响Fig.3 The effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids from hemp leaves

图4 料液比对大麻叶总黄酮浸提量的影响Fig.4 The effect of soild-to-liquid ratio on the yield of flavonoids from hemp leaves

2.2.4 提取温度对大麻叶总黄酮浸提量的影响

以1∶25（g／mL）料液比加入 80&乙醇，在不同提取温度（50、60、70、80、90℃）下水浴提取2.0 h，提取1次，测定不同提取温度对大麻叶总黄酮浸提量的影响。由图5可知，提取温度在50～80℃时，随着温度升高，总黄酮浸提量增加，在80℃时总黄酮浸提量达到最高。当提取温度高于80℃时，总黄酮浸提量下降。这可能是由于温度升高导致分子运动增加，黄酮与溶剂接触增加，故提取量升高，而过高的温度会导致黄酮被氧化，导致提取量降低［27］。因此，80℃是最优提取温度。

图5 提取温度对大麻叶总黄酮浸提量的影响Fig.5 The effect of extraction temperature on the yield of flavonoids from hemp leaves

2.2.5 提取次数对大麻叶总黄酮提取量的影响

以1∶25（g／mL）料液比加入80&乙醇，在80℃水浴锅中，提取4次，测定不同提取次数对大麻叶总黄酮提取量的影响。由图6可知，随着提取次数的增加，总黄酮浸提量逐次减小，提取3次后总黄酮浸提取量几乎不再增加。因此，本研究中最佳提取次数为2次。

图6 提取次数对大麻叶总黄酮提取量的影响Fig.6 The effect of extraction times on the yield of flavonoids from hemp leaves

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面结果分析

利用Design-Expert8.0软件的Box-Behnken设计［28］，以乙醇体积分数、提取时间、料液比和提取温度为自变量，总黄酮浸提量为响应值，进行响应面分析，结果见表2。对数据进行多元二次回归拟合，建立提取工艺参数回归模型。回归方程为：Y＝14．21+1．38A+1．34B+0．84C+0．88D+0．18AB-2．73AC-0．65AD+0．83BC-0．24BD+0．062CD-1．48A2-3．21B2-5．59C2-3．13D2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

续表2

模型的决定系数R2＝0．9105，校正系数，说明该模型能解释82.10&响应值的变化，与实际试验拟合良好，表明该模型可以对总黄酮浸提量结果进行分析和预测。由回归方程各项方差分析中F检验可以判断自变量对因变量的影响。由表3可知，模型的p＜0．0001，表明方程拟合极显著；模型失拟项不显著p＞0．05。A的一次项，B、C、D的二次项、交互项AC，对应的p值远小于0.01，对试验结果影响极显著；B的一次项、A的二次项对应的p值小于0.05，对试验结果的影响显著。此外，还可得出，试验中各因素对黄酮浸提量影响的主次顺序为：A＞B＞D＞C，即乙醇体积分数对黄酮提取率的影响最大，其次是提取时间和提取温度，最后是料液比。

表3 回归方程及方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

2.3.2 交互作用的影响

通过Box-Behnken试验得到多元二次回归模型所作的响应面图，响应面图形是响应值与各试验因素（乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度）所构成的三维空间曲面图。在其他试验因素固定不变的情况下，考察交互项对浸提量的影响，即乙醇体积分数与提取时间、乙醇体积分数与料液比、乙醇体积分数与提取温度、提取时间与料液比、提取时间与提取温度、提取温度与料液比的交互作用对大麻叶总黄酮浸提量的影响，如图7所示。

响应面坡度越陡，表明响应值对于操作条件的改变越敏感，该因素对黄酮得率的影响越大；反之则表明因素对黄酮得率的影响越小。在交互项对得率的影响中，料液比与乙醇体积分数之间交互作用明显，其他因素之间交互作用不明显，这与方差分析的结果一致。

2.4 验证实验

通过Design-Expert8.0软件对回归方程进行多次拟合优化，得出最优提取工艺为乙醇体积分数50&，提取时间2.0 h，料液比 1∶20（g／mL），提取温度 70℃，总黄酮浸提量预测值为14.21 mg／g。按1.3.2的方法进行验证实验，平行3次，测得总黄酮平均浸提量为14.28 mg／g，与预测值14.21 mg／g的误差为0.5&左右，说明采用响应面法优化得到的提取工艺参数可靠，具有实际应用价值。

2.5 总黄酮抗氧化活性分析

2.5.1 FRAP法测定总抗氧化能力

如图8 FeSO4标准曲线所示，随着FeSO4溶液浓度增加，Fe2+-TPTZ增多，测定的吸光度值A593增加。它们之间存在线性关系。大麻叶总黄酮提取液与FRAP工作液反应后测得A593的3次重复值分别为0.409、0.400、0.401，平均值为0.403，与 1.288 mmol／L FeSO4溶液的吸光度A593值相同，表明该总黄酮的抗氧化能力为1.288 mmol／L。

2.5.2 ABTS法测定总抗氧化能力

ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS自由基，而在抗氧化物存在时自由基的产生会被抑制。黄酮抑制ABTS自由基产生的能力可以表示其总抗氧化能力，用相对抗氧化剂Trolox的抗氧化能力表示。如图9 Trolox标准曲线，Trolox浓度越高，ABTS自由基的量则越少，吸光度A414也越小。拟合方程：y＝-1．1226x+0．8032，R2＝0．9973。大麻叶总黄酮提取液与工作液反应后测得的吸光度A4143次重复值分别为0.705、0.644、0.618。总黄酮清除ABTS自由基的总抗氧化能力相当于0.391 mmol／L的Trolox。

图8 FeSO4标准曲线Fig.8 Standard curve of FeSO4

图9 Trolox标准曲线Fig.9 Standard curve of Trolox

2.5.3 DPPH自由基清除活性的测定

由图10（a）可知，随着样品总黄酮浓度的增加，DPPH清除能力增加。在黄酮样品浓度达到0.008 mg／mL时，DPPH清除率达到100&，这表明黄酮清除DPPH自由基的能力与黄酮质量浓度间存在量效关系，拟合方程为y＝12576x+3．3166，R2＝0．9952。阳性对照VC对DPPH自由基清除能力如图10（b），拟合方程为y＝21414x+0．9749，R2＝0．9985。大麻叶总黄酮对DPPH自由基的半抑制浓度IC50为3.7μg／mL，对比VC对DPPH自由基的清除能力（IC50＝2.3μg／mL），可知黄酮清除DPPH自由基能力低于VC。

图10 大麻叶总黄酮（a）和VC（b）对DPPH自由基清除能力Fig.10 DPPH radical-scavenging activities of flavonids from hemp leaves（a）and VC（b）

3 小结

本研究采用响应面法优化了回流法提取大麻叶中总黄酮的工艺，得到最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数50&、料液比1∶20（g／mL）、提取时间2.0 h、提取温度70℃，在此条件下大麻叶总黄酮浸提量为14.28 mg／g。FRAP法、ABTS法以及DPPH自由基清除试验结果表明，大麻叶总黄酮提取物具有一定的抗氧化能力。该研究结果为大麻叶总黄酮的提取提供了参考，同时为大麻叶提取物的生物活性研究提供了前期基础。本研究仅针对大麻叶总黄酮的提取及抗氧化能力进行了研究，大麻叶中黄酮化合物的组成仍需进一步探索。今后可围绕大麻叶中黄酮成分的鉴定、抗氧化应激以及其它生物作用机理等方面进行探究，为大麻叶的多用途开发利用提供更为科学可靠的依据和参考。