麻类脱胶高效菌株DCE01的Pel4I8基因克隆与表达

李琦，成莉凤，曾洁，刘朝阳，刘正初，*

(1.湖南农业大学植物保护学院，长沙410128;2.中国农业科学院麻类研究所，长沙410205;3.湖南利尔康生物股份有限公司，湖南岳阳414100)

纤维作物的生物脱胶 (例如苎麻脱胶)关键控制因素之一就是果胶酶[1]。果胶酶是一类能够降解果胶物质的生物酶的总称，是一种重要的工业酶制剂。果胶酶还广泛应用于果汁澄清、植物提取、废水处理、纸浆漂白[2]等工业领域。按照作用底物的不同，果胶酶可以分为果胶甲基半乳糖醛酸酶 (PMG)、聚半乳糖醛酸酶 (PG)、果胶裂解酶 (PL)、聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)、果胶酯酶或果胶甲酯酶 (PE)、原果胶酶等。按照酶作用的最适pH情况，又分为酸性果胶酶、中性果胶酶与碱性果胶酶。为适应工业化应用的高要求，果胶酶的研究热点正逐步由菌种筛选、酶学性质测定、分离纯化研究转向基因工程、蛋白质工程等分子生物学内容。发掘天然优秀菌株中的优质果胶酶基因，是分子生物学的基础工作之一。

实验室筛选到了拥有14个果胶酶基因的麻类脱胶高效菌株DCE01。为了更好的研究各果胶酶的特性，采用PCR技术克隆了该菌株的一个果胶酶基因Pel4I8，将其与大肠杆菌表达载体pET－28a连接，在E.coli BL21(DE3)中进行了表达。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株DCE01由中国农业科学院麻类研究所工程酶项目组提供;E.coli BL21(DE3)购自Novagen公司;载体pET－28a购自TransGen公司;聚半乳糖醛酸钠、橘子果胶 (不同酯化度)购自Sigma公司;高保真聚合酶购自TransGen公司;UNIQ－10柱式细菌基因组等试剂盒购自上海生工公司;DNA Marker购自Tiangen公司;其他常规生化试剂均为分析纯，购自国药集团。

PCR仪购自BioRad公司;SPX－250B型生化培养箱购自上海博讯公司;LDZX－50KBS型不锈钢立式压力蒸汽灭菌器购自上海申安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种培养

DCE01菌种的活化[3]方法:从斜面保藏菌种挑取一环接种到5mL改良肉汤培养基，充分悬匀，35℃ 静置培养5－8h。稀释涂布固体改良肉汤培养基，35℃静置培养18－20h，分离单菌落。挑选生长旺盛的单菌落接种于5mL LB培养基，35℃，180r/min培养15－18h，供基因组DNA提取或其他用途。

1.2.2 基因组DNA的提取

参照UNIQ－10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书进行。

1.2.3 果胶酶pel4I8基因的扩增

采用软件Primer premier 5设计引物。上游引物带BamH I酶切位点，下游引物带Hand III酶切位点。

以DCE01菌株基因组DNA为模板，扩增体系参照试剂说明书。扩增参数设置为:95℃ 预变性4.0 min，94℃变性30s、55℃退火30 s、72℃延伸1.0 min，共30个循环，72℃保温10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收PCR产物。质粒提取、DNA酶切、连接、转化、DNA片段回收等操作按相关试剂盒说明进行。

1.2.4 果胶酶的诱导表达及粗酶液的制备

挑取阳性基因工程菌株接种培养 (培养条件:37℃、220 r/min)。当OD600达到0.6，添加IPTG进行诱导。发酵液在3500 r/min，4℃的条件下离心10 min，分别收集菌体和上清液。上清液即为胞外酶液。

用适量预冷的生理盐水洗涤菌体并重悬，在4℃下用超声波破碎仪破壁后，14℃、10000 r/min条件下离心10 min，收集上清液即为胞内酶液。

1.2.5 SDS－PAGE电泳

采用12%的分离胶和5%的浓缩胶。根据蛋白质样品的浓度，上样量为5.0－20.0μL。浓缩胶的电压为100V，电流10mA。待进入分离胶后，电压不变，电流调节为25mA。

1.2.6 果胶酶活力单位定义

50℃、pH值9.0条件下，底物每分钟释放出相当于1.0μmol半乳糖醛酸的还原糖所需的酶量为1个酶活力单位，以“U/mL”表示。

1.2.7 果胶酶酶学性质分析

在50℃下测定重组果胶酶在pH 7.5－11.0时的酶活性，确定其最适pH值;在pH 9.0条件下，分别测定其在40－65℃条件下的酶活。

2 结果与分析

2.1 基因克隆

以基因组DNA为模板，获得的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果显示:果胶酶基因Pel4I8电泳条带清晰，目的基因克隆成功。测序结果标明，该基因含有1632个碱基。

图1 果胶酶基因PCR扩增Fig.1 PCR amplification of pectate lyase gene

2.2 质粒转化与酶切

提取转化后阳性菌株的质粒，并在37℃酶切30 min。以质粒DNA为模板进行PCR鉴定。用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物及阳性克隆菌种的质粒PCR产物。结果表明:果胶酶基因Pel4I8已经转化成功，条带大小与目标基因相符。

图2 质粒PCR鉴定与扩增检测Fig.2 Detection of recombinants by PCR

2.3 诱导产酶结果

重组菌株经IPTG诱导8h、21h后的蛋白质SDS－PAGE电泳结果表明:第21h的条带较第8小时的明显，这说明蛋白的表达量随着诱导时间的延长而增多。果胶酶Pel4I8基因编码543个氨基酸，预测的分子量约为63kDa。

图3 果胶酶SDS－PAGE电泳Fig.3 SDS－PAGE of recombinant pectate lyase

2.4 碱性果胶酶的酶学性质

生物酶的作用随着温度和pH的变化而变化，一般来说，温度越高，催化效果越好，但是温度过高，又会破坏蛋白质的结构，甚至使蛋白质失去活性。结果显示，该酶的最佳反应温度为55℃、最佳反应pH为pH 9.5。

图4 温度对重组果胶酶活力的影响Fig.4 Effect of temperature on the activity of recombinant pectate lyase

图5 重组果胶酶的pH值稳定性Fig.5 pH stability of recombinant pectate lyase

工业应用中，人们常常通过比较酶活来评价一个酶的催化效率。然而，酶活的检测往往受到底物等多种因素的影响。这在果胶酶Pel4I8上尤为明显。分别采用四种酯化度各不相同的橘子果胶为底物，检测到的酶活相差较大。用酯化程度在55%－70%的橘子果胶作底物检测时酶活最高，以酯化程度≥85%的橘子果胶为底物时，几乎检测不到酶活。

图6 不同底物对酶活力的影响Fig.6 Effect of substrates on enzyme activity

3 讨论

自然界中的产果胶酶微生物往往可以分泌多种不同类型的果胶酶，这些酶的酶学特性往往有很大的差别，认真分析和研究这些差异性，既是拓展工业酶精细化应用的需要，也是开发新型高效酶制剂的基础。酶法脱胶中更偏向于选择碱性果胶酶而不是酸性果胶酶，因为碱性环境下纤维素降解会受到抑制[4]。在麻类脱胶工序中，果胶酶与果胶酶之间有协同作用，果胶酶与其它酶复合使用，更能降低能耗，提高生产性能。Kaur等在红麻生物制浆中利用果胶酶与木聚糖酶协同作用，提高了纸浆性能[5]。因此，实际应用中，既要考虑果胶酶的酶学特性，还要考虑起协同作用的其它酶制剂的酶学特性，只有各酶种的特性类似，组合使用时才能发挥最佳效率，否则，会或多或少降低某一种酶的催化效率，造成浪费。

进行蛋白表达时，有些胞内酶不能正确折叠和修饰，还会形成包涵体，即使纯化出来也不一定能成功复性[6]。据报道，采用pEASY－E1载体进行该酶基因的表达时，尚未检测到胞内酶活性和胞外酶活性[3]，而采用pET－28a载体时，两者均检测到了活性。表达载体的选择可能对该酶的表达影响较大。

通过Blast序列分析发现，在核酸序列上，Pel4I8基因与来自Dickeya dadantii 3937的pelW基因[7]相似程度为93%，有109个差异点，而在氨基酸序列上的差异性要小一些，有9个氨基酸不同，相似度为97%。

据报道，尽管不同来源的果胶酶酶学性质存在差异，但是，大部分碱性果胶酶最适pH值为8.0～l0.0，最适温度范围为50～60℃[8]。Li Zuming等[9]报道的果胶酶最适反应pH值为10.0;徐伟等报道的果胶酶最适pH值为9.0～9.5，在pH 7.0～10.0之间催化性质较稳定;最适作用温度范围为45～55℃[10]。本研究中的果胶酶最适pH值为9.5，但在pH 9.0及10.0时，酶活仅为高峰时的61%和42%，这说明外部pH对酶的影响较大。在40－55℃温度区间，酶活稳定上升，最适温度为55℃，这与已报道的研究相吻合。

工业应用中，用酶环境较复杂，温度和pH一般都有一定的波动范围，这对工业酶的推广与普及是一个挑战。设计一个在较宽的温度和pH范围内相对稳定的酶蛋白是今后工业酶制剂开发的一个方向，此外，还将加强提高酶的表达量及催化效率方面的研究，为该酶的工业化应用打下基础。

[1]郑科，刘正初，段盛文，等.果胶酶在麻类脱胶中的应用及其作用机理[J].生物技术进展，2012，2(6):404－410.

[2]Murad HA，Azzaz HH.Microbial pectinases and ruminant nutritior[J].Research Journal of Microbiology，2011，6(3):246－269.

[3]成莉凤.DCE－01菌株果胶酶基因克隆与表达及其多样性研究[D].北京:中国农业科学院，2013.

[4]白延坤，刘秉钺，何连芳.韧皮纤维生物脱胶的研究进展[J].造纸科学与技术，2006，25(2):34－38.

[5]Kaur A，Mahajan R，Singh A，et al.Application of cellulase－free xylano－pectinolytic enzymes from the same bacterial isolate in biobleaching of kraft pulp [J].Bioresour Technol，2010，101(23):9150 －9155.

[6]Jayani RS，Saxena S，Gupta R.Microbial pectinolytic enzymes:A review [J].Process Biochemistry，2005，40(9):2931－2944．

[7]Glasner JD，Yang CH，Reverchon S，et al.Genome sequence of the plant－pathogenic bacterium Dickeya dadantii 3937 [J].Journal of Bacteriology，2011，193(8):2076–2077.

[8]Pedrolli DB，Monteiro AC，Gomes E，et al.Pectin and pectinases:production，characterization and industrial application of microbial pectinolytic enzymes[J].The Open Biotechnology Journal，2009，7(3):9 －18.

[9]Li Zuming，Bai Zhihui，ZhangBaoguo，et al.Purification and characterization of alkaline pectin lyase from a newly isolated Bacillus clausii and its application in elicitation of plant disease resistance [J].Applied Biochemistry Biotechnology，2012，167(8):2241－2256.

[10]徐伟，付大伟，姚晓静.基因工程菌Escherichia coli BL21/pET－pel重组果胶酶的纯化及酶学性质[J].食品科学，2014，35(23):245－248.