亚麻抗白粉病基因SAGE分析

陈思，杨秀坤，王珣，李柱刚，杨帆，吴广文，刘岩，金慧，周春薇，杨学*

(1.黑龙江省农业科学院，黑龙江 哈尔滨 150086；2.黑龙江省绥化市庆安县欢胜乡农业技术服务中心，黑龙江 绥化 152461)

亚麻白粉病是由亚麻粉孢(OidiumliniSkoric)引起的一种世界性的真菌病害。在亚麻主要种植区，白粉病均有发生[1-3]，且日趋严重，对亚麻种子及纤维的产量和质量造成严重的威胁[4-5]，培育抗病品种是解决该问题的关键。采用生物技术的分子育种相比于传统的育种手段，具有快捷、准确、外界因素难以干扰等优点，能够极大加速目标基因的确定和利用，较早淘汰不利相关性状，从而达到缩短育种周期，提高育种效率的目的。

基因表达系列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)技术不仅可以在较短的时间内对细胞中近乎全部的mRNA进行检测，而且可以定量分析这些mRNA的表达拷贝数，同时能使潜在的未知基因得以发现[6]，该技术的发明与应用对细胞基因表达频谱方面的研究具有重要意义。该项技术是以寡核苷酸序列标签(tag)对mRNA转录物进行特异性地确定，然后将多个标签(20～60个)用连接酶随机串联起来形成多个多联体(concatemer)，再将其克隆到载体中，随后对全部克隆进行测序，其中标签来自于转录子(cDNA)上的特定区域，大小为9～14 bp。经SAGE软件分析，可使表达的基因种类得以确定，此外标签出现的频率能够反映出基因的表达丰度，进而构建SAGE文库。对在特异组织中表达的差异基因或是在各种胁迫条件下表达的差异基因进行分析时，SAGE是一种非常有效的方法，因而在植物抗逆性研究方面得到了一定的应用。Matsumara等[7]将SAGE技术应用到稻瘟病菌侵染后水稻基因表达情况的研究中，结果发现，病原菌细胞壁提取物能够诱导产生抗真菌蛋白质以及与防御信号传导可能存在相关性的一些基因，与此同时还发现了可能参与细胞凋亡过程的基因。Mitchell等[8]为了解与寄主抗性和病原菌致病力相关的基因，采用SAGE方法对水稻与稻瘟病菌之间相互识别及病理反应开展全基因组分析，最终获得包含水稻和稻瘟病菌基因互作的400多个微列阵芯片并得以应用。Gowda等[9]为了获得基因表达谱以及确定新的抗性基因，将LongSAGE新方法应用于水稻和稻瘟病菌互作过程中基因表达的综合分析。Mysore等[10]将番茄转录因子Pti4(Pto互作蛋白)在模式植物拟南芥中表达，根据SAGE方法对受Pti4因子调节的基因进行了鉴定。Portieles等[11]利用SuperSAGE和第二代测序技术构建了烟草与立枯丝核菌互作过程的转录组文库，并分别获得了8960个上调和8221个下调的差异标签。通过前人的研究结果可以看出，植物的抗病性与植物本身以及病原物的基因均有关，对这些基因客观、正确的认识，对在基因角度了解植物抗病性非常重要。SAGE技术在不断改良和创新，在原SAGE基础上的新技术LongSAGE，既可以在短时间内对新基因和外显子加以鉴定，又可以在大量的基因表达分析和基因组的注释方面有突出表现[12]。目前该技术在昆虫的基因表达分析中应用也较为广泛[13-15]。

SAGE技术建立在两个基本原理之上，一是在一个转录体系中，每种转录本都可以用一个特异的固定长度寡核苷酸序列(9～l6 bp)来代表，这些短序列称为SAGE标签(SAGEtag)，通过一定的试验步骤，可将这些标签从cDNA中分离出来制备成一个SAGE标签库，然后连接成标签多聚体进行克隆测序；二是每种标签在全部标签中所占的比例可以反映其所代表的转录本在整个转录体系中的表达丰度。因此本SAGE标签数据库中具有显著差异表达丰度的转录组即代表了抗白粉病性状相关的表达基因(转录组)。利用SAGE技术分析基因在转录水平的表达情况，开展亚麻抗病育种，能够缩短抗源筛选和抗性基因鉴定的时间，使抗性基因的合理利用得以加快，并且能够尽快地在同一优良品种中聚合到多种抗病基因。目前，国内外对于亚麻白粉病的致病机制还没有进一步的研究。本研究参照其他农作物基因表达系列分析的研究，利用SAGE技术对亚麻抗白粉病材料(9801-1)进行分析，获得I-SAGE标签库，旨在为今后高抗白粉病育种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从黑亚11号田间自然变异突变体选育出亚麻抗白粉病材料9801-1，对亚麻白粉病的抗性遗传进行了分析，证实了黑亚11号田间自然变异突变体(9801-1)对白粉病的抗性属于显性单基因遗传[16]。本研究以亚麻抗白粉病材料9801-1及其感病对照黑亚11号为基础建立了亚麻抗白粉病SAGE标签数据库。将供试材料播种于黑龙江省农业科学院民主试验园区中，于亚麻快速生长期将温室内用亚麻活体繁殖的病原菌移置田间，使其分生孢子自然接种到供试材料上，待充分发病时取样，后立即用液氮冷冻保存备用。

1.2 mRNA的分离

采用Trizol试剂总RNA提取试剂盒(Catalog no.K15596-026)提取RNA，提取后的RNA样品适当稀释后，用紫外分光光度计检测RNA的纯度，记录OD260/OD280值，并用常规1%琼脂糖凝胶进行琼脂糖溴化乙锭电泳检测RNA完整性。mRNA的分离纯化采用美国Qiagen公司的Oligotex®mRNAMi-di试剂盒，具体操作步骤见试剂盒说明书。

1.3 SAGE库的构建

SAGE库的构建采用In-vitrogen公司的I-SAGETMLONG试剂盒，具体操作步骤简要描述如下：用生物素标记的oligo dT为引物将所得的mRNA反转录合成cDNA，用限制性内切酶NlaⅢ(锚定酶anchoring enzyme，AE)酶切，然后采用链霉素亲和性磁珠收集cDNA 3′端部分；用NlaIII消化cDNA后，将收集的cDNA分为两部分，分别用T4DNA连接酶连接一个cDNA池到LS接头A，连接另一个cDNA池到LS接头B，每一种接头都含有IIS类型限制酶MmeI(标签酶tagging enzyme，TE)的识别位点；用MmeI酶切产生连有接头的短cDNA片段，混合两种不同接头的cDNA片段，构成双标签后，以接头上的引物进行PCR扩增；最后用锚定酶酶切扩增产物抽提双标签片段，用T4DNA连接酶连接双标签，并进行克隆、测序。详细操作见试剂盒说明书。

1.4 文库标签数量的计算

每个克隆标签的总数=插入片断的大小/17(标签的大小)

每个克隆标签的总数×克隆的数量/μL =标签总数/μL

根据34 bp双标签串联体的平均大小以及克隆的数量可以大致估算出I-SAGE标签库的标签数量。

2 结果与分析

2.1 cDNA合成效率

用常规1%琼脂糖凝胶进行琼脂糖溴化乙锭电泳检测cDNA合成效率，结果见图1。由图1可知，在以亚麻合成cDNA为模板的泳道上出现1条清晰的350 bp条带，证实cDNA合成成功并且合成效率可以满足试验要求。

注：1-泳道100 bp ladder；2、3-以亚麻抗病材料9801-1及其感病对照总RNA合成的cDNA为模板配合其特异性引物的PCR产物；4-阴性对照；5-以血液细胞总RNA合成的cDNA为模板配合其特异性引物的PCR产物。

2.2 130 bp双标签产量控制及凝胶纯化

PCR后，取稀释至10%的样品于4%琼脂糖凝胶上样进行琼脂糖溴化乙锭电泳，检测130 bp双标签Nla III消化结果(见图2)。通过在凝胶成像下比较双标签和LS对照模板的浓度来确定双标签的产量，也可以用低分子量DNA ladder鉴定双标签的产量。通常需要20～200 μg的双标签用于下一步反应，实施大规模PCR扩增获得理想的产量。从图2可以看到清晰的130 bp的双标签带和一个微弱的100 bp条带(仅含有接头序列，没有转录序列)。以1∶40稀释比例，27～30个循环即能得到较好结果。将PCR后的130 bp双标签产物用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，经凝胶洗脱亲和层析柱纯化后用于下一步反应。

注：1、7-100 bp ladder；2-不含模板的阴性对照；3-不含连接的阴性对照；

2.3 34 bp双标签的纯化及串联体的形成

凝胶纯化后的130 bp双标签经Nla III消化后得到34 bp条带，将34 bp双标签经凝胶洗脱亲和层析柱纯化(见图3)。将所有样品点到2%琼脂糖凝胶的一个点样孔中后开始电泳，当溴酚蓝前沿到底部3/4处结束电泳。将凝胶置于0.5～2 μg/mL溴化乙锭中染色，紫外灯下观察条带，可见弥散的约100 bp到1 kb条带，结果如图4。将300～500 bp、500～800 bp、800～1000 bp的产物切下，经凝胶洗脱亲和层析柱纯化用于下一步克隆反应。

注：M-Marker；1-双标签。

图3 凝胶纯化34 bp双标签Fig.3 Gel-purifying of the 34 bp ditag

注：M-100 bp ladder；1-串联体。

2.4 I-SAGE标签的计算

在I-SAGE标签库中75%以上的克隆应大于400 bp(阴性为200 bp)，I-SAGE标签库的数量决定于产物包含大插入片断的百分比。

根据34 bp双标签串联体的平均大小以及克隆的数量估算I-SAGE标签库的数量：

亚麻抗病材料9801-1 I-SAGE标签库的数量=700(平均串联体的大小)/17 × 496(克隆的数量)=20423

亚麻感病对照I-SAGE标签库的数量=700(平均串联体的大小)/17 × 532(克隆的数量)=21905

3 结论与讨论

SAGE是基因表达水平差异分析和大规模发现新基因的分子生物学技术[17-18]，作为一种高通量的表达基因检测方案，SAGE获得基因表达频谱十分方便，是目前获得特定组织的全部表达基因的最好方法。SAGE的特点是单一转录体由其特异性的短标签所代替，标签连接后组成的串联体克隆到质粒内进行扩增后测序，标签的丰度即代表某种转录体的水平。以21 bp的标签代表某一mRNA为例，4种不同的碱基随机组合，理论上应能得到421(4398046511104)个标签，而人类基因组预测的编码基因在28642与153478之间[19]，因此足以涵盖所有已知物种的基因，出现重复的几率为0。

在凝胶成像下比较双标签和LS对照模板的浓度可以确定双标签的产量。通过比较双标签和LS对照模板特定稀释浓度的强度来测定130 bp双标签的产量，如果130 bp双标签产量接近LS阳性对照模板的产量，需要至少200～300 个PCR反应；如果130 bp双标签产量明显少于LS阳性对照模版的产量，则需要至少400～600个PCR反应。

本研究以亚麻抗白粉病品系9801-1及其感病对照黑亚11号为基础，提取时间为接种白粉病菌后，感病品种发病而抗病品种未发病的时期，采用具有更高特异性的I-SAGETMLONG KIT，用一个特异的固定长度(21 bp)寡核苷酸序列(SAGE标签)代表转录体系中的每种转录本，将这些标签从cDNA中分离出来制备成一个数量在20000余个的SAGE标签库，试验结果未来可以直接与SAGEmap表达数据库中不同来源的数据相比较，并可将基因表达的数据保留下来，作为分析亚麻抗白粉病基因表达差异之用。通过对SAGE标签数据库中表达有明显差异的标签进行分析，有望找到一系列与亚麻抗白粉病性状表达相关的基因，进而通过这些mRNA表达差异分析亚麻白粉病分子调控机制。根据文献记载[20]，一个高质量I-SAGE标签库产量达100000个标签，本试验产生标签20000余个，明显低于参考值，产生这一现象的主要原因为亚麻的基因组总量偏低，mRNA数量本身就明显低于参考物种(人类、水稻)。因此即使标签的数量略少，仍能代表转录体的表达水平，用于准确定量分析标签的丰度。

作为目前唯一以测序为基础的定量分析全基因组表达模式的技术，SAGE技术在定量分析各转录子表达水平及检测表达丰度等方面具有明显优势。本研究建立的亚麻抗白粉病SAGE标签数据库将为亚麻抗白粉病研究的深入开展和应用起到巨大的推动作用。