微生物工业酶及其后处理工艺研究进展

李琦，成莉凤,#，汪启明，刘清波, 罗玮，彭源德*

(1.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；3.江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

酶是具有生物催化功能的高分子物质，可通过人工合成法和生物合成法两种途径获取。生物合成法就其来源可分为动物酶、植物酶和微生物酶三大类。微生物酶是由微生物细胞产生的蛋白质，可催化生物体系中的特定反应，其催化作用具有底物特异性、位置特异性、立体特异性等特点。与化学催化剂相比，微生物酶的催化作用具有高效性和专一性，因此，微生物酶广泛应用于制药、造纸、纺织、饲料、食品、皮革等工业领域[1-3]。

自然界中微生物族群数量庞大，但目前为止人类获得的微生物种类和数量仍非常有限，而能应用于工业生产中的微生物酶则更少。通过全面解析目标酶的溶解性、等电点、分子量等理化性质，选择合适的后处理方法，对后续的功能开发和实际应用均十分必要。本文结合微生物酶的菌种筛选、菌种改良、发酵工艺等环节，重点对酶的后处理方法进行综述，以期为微生物工业酶资源发掘提供科学依据。

1 微生物酶的菌种来源

1.1 菌种筛选

从特殊生境中采集样品，采用选择培养基初筛，以目标活力大小为指标复筛，是一种能获得产酶周期短、酶活力高的优良菌种的简便高效方法。李豪等[4]从腐殖质土壤中用羧甲基纤维素钠培养基初筛，再经过酶活复筛得到一株高产纤维素酶菌株BacillussubtilisB17，其羧甲基纤维素酶(CMC酶)酶活达85.48 U/mL、滤纸酶(FPA酶)酶活达59.8 U/mL，在农作物秸秆饲料的生产方面具有潜在的开发价值。张庆芳等[5]以大连黄海海泥和海水为材料，分别采用透明圈法、酶偶联分光光度法进行初筛和复筛，获得一株产酶活性及稳定性良好的菌株BacillusfastidiosusZ7，其尿酸氧化酶酶活高达673.7 U/mg，可为尿酸氧化酶的工业化生产提供原始材料。Cheng等[6]从老芭蕉园、槟榔谷、玉米地等特殊生境中采集土壤样品，采用苎麻富集培养，利用果胶平板水解圈法获得具有脱胶功能的菌株Bacilluscereus1-1，发酵处理10 h的苎麻和红麻失重率分别为27.9%和23.8%，其胶质去除效果达到或接近现有高效菌株DCE01。

1.2 菌种改良

从自然界筛选出的天然菌株往往活性、耐受性比较差，不能直接满足工业化生产的要求。为了加快微生物的生长速度，提高产酶能力，可从细胞遗传学和分子遗传学角度改良菌种。Yang等[7]报道Bacillusalcalophilus的碱性淀粉酶基因在B.subtilis中过量表达，使碱性果胶酶产量提高76倍。杜海英等[8]采用紫外线诱变和60Co-γ射线协同诱变的方法，对黑曲霉Uco-3的原生质体进行诱变处理，获得产高温乳糖酶的高产突变株，其产乳糖酶活力达44.37 U/mL，是出发菌株的2.73倍。Chirumamilla等[9]利用突变技术(易错PCR、DNA改组、点突变等)可改变酶的底物特异性、活性、对应选择性和热稳定性等特点，使酶向适宜工业化应用的特征定向进化。赵天惠等[10]采用脉冲强光对B.subtilis进行诱变处理，获得兼具高温耐受、强酸耐受和高浓度胆盐耐受性变异菌株B3和B7，产蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶活力分别比原始菌株提高了56%和71%、67%和77%、34%和42%，变异菌株产酶稳定性较高，可遗传变异。朱运平等[11]采用常温、常压等离子体诱变(ARTP)对产葡萄糖氧化酶的黑曲霉1504 菌株进行诱变育种，获得的2 株菌株A117和A158的产酶活力提高至原始菌株的3.17 倍和3.31倍，分别达到172.72、180.74 U/mL。微生物菌种改良涉及重组DNA技术、原生质体融合和点突变技术等，通过增加酶基因的拷贝数或改变基因的特殊位点，以期提高表达酶的活力和改良酶的特性，使酶向适宜工业化目标定向改造。

2 微生物酶的发酵工艺优化

2.1 发酵方式选择

在微生物酶的工业生产过程中，发酵是菌种产酶的重要环节。发酵方式主要有固态发酵和液态发酵两种形式。细菌产酶通常是用液体深层培养发酵，而真菌产酶则更适于采用固体培养法生产，固体培养具有不易污染、容易管理、节省能源、单位容积产量高等优势。对常见的果胶酶工业生产而言，固体培养的生产成本低，培养物易于分离，在果胶酶工业化生产中占主导地位。

2.2 发酵条件优化

微生物发酵产酶与培养基的营养成分(碳源、氮源、无机盐等)和发酵外界条件(初始pH、培养温度、培养时间等)相关。液体发酵通常采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等作为基础营养物，再针对具体的工业酶种类辅以合适的诱导物；固体发酵则以麸皮、豆粕、稻草等植物秸秆、橘皮、香蕉皮等工农业废弃物为主要原料。成莉凤等[12]通过优化B.subtilisBE-91产胞外β-甘露聚糖酶的摇瓶发酵条件，获得了最佳发酵培养基配方：0.9%魔芋精粉、0.4%大豆蛋白、0.1% (NH4)2SO4、0.5% NaCl，在魔芋精粉的诱导下，β-甘露聚糖酶活力最高达432.4 IU/mL，比优化前提高了40%。冯志彬等[13]分离并获得一株具有较高L-天冬氨酸α-脱羧酶分泌能力的BacillustequilensisPanD37，经发酵条件优化后L-天冬氨酸α-脱羧酶活力可达44.57 U/mL，比优化前提高2.57倍，有望应用于β-丙氨酸的工业生产。根据微生物的生长与代谢规律，一般前期主要是微生物菌体迅速生长繁殖，稳定期后，微生物产酶才能达到高峰。Apastambh等[14]对黑曲霉在30 L搅拌通气发酵罐中的生长及产酶模式进行了研究，发现酶的合成主要发生在两个阶段，第一阶段与菌体生长相关，在菌体达到对数生长期时结束；第二阶段与菌体生长不相关，发生在分解代谢阻遏的结束期。

3 微生物酶的后处理工艺选择

微生物酶的后处理工艺大致包括3个阶段：酶的释放和粗分离、提纯提取和精细分离。为了获得最大纯化倍数和回收率，需要结合不同机制分离单元的提纯方法组成一套工艺，提纯方法的次序选择至关重要，其选择原则包括：集成不同分离原理的方法组合成整套工艺；优先采用高效的分离方法去除含量高的杂质；最后采用价格昂贵、费时的分离方法[15]。优化的工艺组合不仅能获得较高的纯化倍数和回收率，而且工艺简化，更换较少条件即可使各步骤有机衔接。

3.1 沉淀

微生物酶在溶液中的稳定性与分子大小、带电荷量和水化作用有关，改变外界环境条件会影响酶蛋白的稳定性，使酶蛋白沉淀析出。发酵液通过离心或过滤的方式去除菌体细胞，上清液可用超滤、(NH4)2SO4沉淀或有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮等)抽提等方法进行初步浓缩和分离。胞内酶先进行细胞破壁，再采用(NH4)2SO4沉淀和浓缩，也可采用梯度浓度的乙醇或丙酮分级沉淀。韦荣霞等[16]用20%～50%硫酸铵分级盐析曲霉RSD发酵液中的生淀粉糖化酶，获得比酶活力为185.43 U/mg，纯化倍数为2.29，回收率为75.4%；苏明慧等[17]用45%～65%乙醇分级沉淀来源于短短芽孢杆菌FM4B发酵液的几丁质酶，获得比酶活力为105.85 U/mg，纯化倍数为1.74，回收率为73.1%。最常用的微生物酶分离采用(NH4)2SO4分级沉淀，因为硫酸铵具有溶解度大、对温度变化不敏感、分级效果好等优势。

3.2 膜分离

膜分离作为一种新兴的高效分离浓缩技术，由于兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能已广泛应用于工业酶的大规模生产。与常规方法相比，膜分离能节约化学试剂，缩短分离周期，且能大幅度提高酶的浓缩倍数和回收率，是一种适用于微生物工业酶提取的高效和经济的物理分离方法[18]。程小飞等[19]对粗酶液预处理，再进行超滤，使溴过氧化物酶比活达212 U/mg，纯化了21倍，酶活回收率为96%。陆俊等[20]研究了中空纤维超滤膜分离提纯大蒜超氧化物歧化酶的工艺参数，对酶液先后进行超滤和纳滤处理，在最佳分离条件下，SOD单位酶活力达33.31 U/mL，比活力30.04 U/mg，回收率51.02%。

在发酵液后处理过程中采用膜分离技术可以除杂，加速酶的复性。微滤、纳滤和超滤膜均适用于该加工过程(见表1)[21]。发酵液后处理过程中采用超滤和纳滤，能使反应器内的底物和酶维持结合状态，有利于去除抑制反应的组分[22]。采用膜过滤技术的优点主要如下：省时省工；成本低；高温下可操作，能源利用率高；可针对具体产品要求设计工艺；较分批发酵而言，更适用于连续发酵。

表1 常见膜分离过程特性

Table1 Common characteristic of membrane separation processes

种 类分离机制分离物大小结 构组 件材 料微滤以压力为驱动力,主要依靠机械筛分作用可滤除大于50 nm的颗粒对称高分子膜褶叠式、膜片式、缠绕式等聚氯乙烯膜、再生纤维素膜、聚丙烯膜、聚酰胺、聚四氯乙烯、陶瓷和不锈钢等超滤以压力为驱动力,主要依靠机械筛分作用可滤除5～100 nm的颗粒非对称多孔膜中空纤维、平板式、管式等聚砜、醋酸纤维素、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺和陶瓷等纳滤以压力为驱动力,主要依靠溶解扩散效应低分子有机物的脱盐纯化非对称膜和复合膜卷式、平板式和管式聚砜、醋酸纤维素和芳香族聚酰胺复合材料等

3.3 层析

酶的常规分离纯化方法有凝胶过滤层析、亲水层析、疏水层析等(见表2)[15]。单一的层析方法难以达到理想的分离效果，实际应用中常联合几种层析方法，或者结合其他不同原理的分离方法。离子交换、疏水层析和亲和层析会使酶蛋白质浓缩, 而凝胶过滤色谱会使样品稀释。在离子交换层析后进行疏水层析，不需置换缓冲液，因为多数酶蛋白在高离子强度下与疏水介质结合能力较强，最后进行凝胶过滤层析又可直接换成合适的缓冲体系以利于酶蛋白产品成型保存。刘艳如等[23]结合阴离子交换层析和凝胶层析分离Burkholderiasp. ZYB002 胞外脂肪酶，获得比酶活力为1902.5 U/mg，纯化倍数为8.98，回收率为11.36%。李晔等[24]结合硫酸铵分级沉淀、Butyl FF 疏水层析及Superdex TM 200凝胶过滤层析等方法对BacilluscereusR75E菌株分泌的胶原酶进行后处理，获得了纯度高于90%的胶原酶，其比活力达到8.289 U/mg，纯化倍数达到18.4倍。

表2 微生物酶的层析纯化技术

Table 2 Chromatography technology used in microbial enzymes

方 法技术原理特 点用 途凝胶层析分子大小 分辨率适中;分级分离时流速较慢;脱盐时流速快,容量受样品体积限制适用于纯化的后期阶段,脱盐可用于任何阶段,特别是步骤衔接时的缓冲液更换离子交换电荷 分辨率较高;视支持物不同流速可很快;容量很大,不受样品体积限制最适用于大体积样品且蛋白纯度较低的样品早期纯化,可分批操作疏水层析疏水极性 分辨率较高;流速快;容量很大,不受样品体积限制适用于纯化的任何阶段,特别适用于离子强度较高的样品,如沉淀、离子交换后的样品亲和层析生物亲和性分辨率极高;流速很快;容量视配体可大可小,不受样品体积限制适用于纯化的任何阶段,特别是样品浓度小、杂质含量多时,可以减少纯化步骤聚焦层析等电点 分辨率较高;流速快;容量大,不受样品体积限制最适用于纯化的最后阶段

3.4 电泳

电泳是荷电溶质(电解质)或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象，是分离酶蛋白和鉴定酶纯度的重要方法。常见的电泳法有十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和等电聚焦电泳(IFE)。严芬等[25]采用DEAE-650C弱阴离子交换层析、CM-650M弱阳离子交换层析、Sephacryl S-200 凝胶层析和Octyl Sepharose CL-4B疏水层析等组合处理工艺，从绿色木霉M1 发酵液中分离纯化得到4个电泳纯的内切葡聚糖酶组分(EG1、EG2、EG3 和EG4)，分子量分别为25.4、28.8、56.3、60.5 kD。王强[26]对B.subtilisQ1发酵液中的葡甘聚糖酶用硫酸铵沉淀、透析、超滤离心和Sephadex G-100凝胶过滤层析，获得电泳纯酶。

4 微生物酶的优势与工业化应用

与植物酶和动物酶相比，微生物酶更适合工业化生产，其主要有以下优势：可大规模发酵生产，且简便、经济；提取和纯化工艺简单，酶回收率高；能够在有限的空间和时间周期内，在不同的环境条件下产生多种酶；可进行基因操作，易获得更高产量的酶。

微生物酶已广泛应用于皮革、食品、纺织品、化妆品、洗涤剂和药品等工业领域。在制药工业，微生物酶可以合成抗生素、治疗皮肤溃疡、用于消化系统病症的治疗等[27]；在饲料工业，微生物酶能显著提高动物平均体重和生产性能[28]；在烘焙领域，葡萄糖氧化酶可以有效提高面团工艺性能和面包质量并延长面包保鲜期[29]；在乳制品行业，微生物酶可作为添加剂，解决乳制品的结晶问题[30-31]；在纺织工业，纤维素酶可精炼纤维使植物纤维更易染色等[32-34]。

5 展望

天然微生物酶没有得到充分发掘与利用，如何利用好自然界微生物这个巨大的酶宝库是值得关注的焦点。因此，筛选与改良高产微生物酶的菌种、开发简便高效的发酵工艺和 “绿色、环保”的分离纯化工艺是微生物工业酶后处理的关键环节。

微生物酶的后处理工艺与发酵条件有关，培养介质的性质、消泡剂、菌龄等均可不同程度地影响发酵液中目标酶的后续回收工艺。与层析法相比，沉淀法受非蛋白质杂质干扰的程度较小，且能获得大量目标酶。此外，应用现代膜分离技术可大幅度提高工业酶下游处理的总回收率、比酶活力和纯度等关键参数，被认为是能替代化学方法的一种高效节能、环境友好的工艺。