栽培亚麻与红花亚麻种间杂交及其幼胚挽救的研究

程莉莉，关凤芝，吴广文，于莹，黄文功，赵东升，袁红梅，侯佳欣

(黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086)

栽培亚麻与红花亚麻种间杂交及其幼胚挽救的研究

程莉莉，关凤芝*，吴广文，于莹，黄文功，赵东升，袁红梅，侯佳欣

(黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086)

为了探讨野生亚麻资源在栽培亚麻育种中的应用，对栽培亚麻与红花亚麻进行种间杂交以及幼胚挽救研究。结果表明;最佳的幼胚剥离时期是授粉后15-19d;剥离的幼胚能够在MS+0.1mg/L NAA+5 mg/L玉米素+15g/L蔗糖+15 g/L葡萄糖+0.8%琼脂，pH5.6培养基中诱导出愈伤组织。初步建立了亚麻种间杂交幼胚挽救技术体系，此研究为红花亚麻应用于栽培亚麻育种奠定了基础。

亚麻;远缘杂交;胚挽救

栽培亚麻(Linum usitatissimum)，隶属亚麻科亚麻属，是我国重要的纤维经济作物［1-2］。培育优质、高纤、耐逆性强的栽培亚麻品种，成为了亚麻育种的主要工作目标［3］。远缘杂交是作物育种中广泛应用的一种方法，栽培亚麻和野生亚麻种间杂交能够对亚麻进行品种改良以及种质创新［4-5］。红花亚麻(Linum grandiflorum)隶属亚麻科亚麻属，作为父本材料红花亚麻与栽培亚麻进行种间杂交，自然条件下幼胚败育，不能得到成熟的种子。幼胚挽救技术能够克服这种现象。对杂交后形成的幼胚实施胚挽救措施后，能够获得再生植株。

本文以栽培亚麻杂交F1代和红花亚麻为材料，进行种间杂交试验。通过对幼胚剥离时期的确定，以及愈伤组织培养基的筛选等研究，对杂交后形成的幼胚进行离体培养，初步建立幼胚挽救体系。为建立一套完整高效的红花亚麻诱导技术体系以及将此方法应用到亚麻育种实践提供相应的理论基础与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试栽培亚麻杂交F1代材料(见表1)以及红花亚麻由黑龙江省农业科学院经济作物研究所提供。将材料进行盆栽种植，为使花期相遇，红花亚麻早于栽培亚麻5天播种。

表1 栽培亚麻F1代材料编号及亲本组合信息Tab.1 Serial number of F1and parental combinations

1.2 方法

1.2.1 人工杂交授粉

当栽培亚麻和红花亚麻生长发育处于花期时，选取第二天能开花的栽培亚麻花蕾，打开萼片，去掉花瓣及花药，第二天早晨将红花亚麻花粉涂抹于栽培亚麻柱头及整个花柱。合拢萼片，用薄棉花包裹杂交后的花蕾，编号挂牌并记录杂交日期。观察杂交后蒴果膨大情况，统计材料杂交后蒴果膨大率(蒴果膨大率=膨大蒴果数/杂交花蕾数*100%)。

1.2.2 培养基配制

使用MS培养基为基本培养基。设置添加激素浓度，配制不同的愈伤组织诱导培养基(见表2)。

表2 愈伤组织诱导培养基成分表Tab.2 Medium compositions for callus inducement

1.2.3 蒴果的消毒

在亚麻授粉后10-24d内分别取明显膨大的蒴果进行试验研究。用70%的酒精将蒴果灭菌30s，无菌水冲洗后，将蒴果放入有效氯含量1%的次氯酸钠溶液中消毒2次，每次10min，最后用无菌水冲洗3次，每次5min。将已灭菌的蒴果放入含有液体MS培养基(MS+15g/L蔗糖+ 15g/L葡萄糖，pH5.6)的培养皿中备用。

1.2.4 幼胚的剥离与培养

选取一枚蒴果，用手术刀将蒴果底部横切掉，再将蒴果纵切，取出种子。将种子放于体视显微镜视野下，利用镊子和手术刀，将幼胚从较大的种子中剥离出来，统计剥离出的幼胚获得率(幼胚获得率=幼胚/剥胚的种子×100%)。将剥离的幼胚放入愈伤组织诱导培养基中培养。较小的种子未进行剥胚处理，直接放入愈伤组织诱导培养基中培养。培养条件:22℃条件下倒置暗培养2周后，进行16h光照/8h暗培养。观察培养基培养条件下幼胚形成愈伤组织状态，统计幼胚愈伤组织形成率，筛选最适愈伤组织诱导培养基。

2 结果与分析

2.1 不同材料在不同时期的蒴果膨大率

试验期间根据不同批次材料的花期进行了3个时间段的杂交授粉工作，3个时间段为:(1)、5月29日-6月16日;(2)、6月30日-7月11日;(3)、8月9日-8月24日。分别统计不同材料的蒴果膨大率(见表3)。

表3 栽培亚麻杂交后蒴果膨大率Tab.3 Ratio of swelled capsules

在不同阶段的蒴果膨大率不同。总体趋势是阶段(2)蒴果膨大率最高，阶段(1)蒴果膨大率最低。栽培亚麻材料之间的蒴果膨大率有所不同，材料11065平均蒴果膨大率最高(80.26%)，材料11021蒴果膨大率最低(64.03%)。

2.2 幼胚剥离时期的确定

选取授粉后10-24d膨大的蒴果作为试验材料进行剥胚处理。结果表明(见表4)，授粉后10-14d剥离出的幼胚获得率较少。授粉后15-19d和授粉后20-24d剥离出的幼胚获得率较多。授粉后20-24d的材料(见图1)，由于授粉后时间较长，幼胚的颜色由绿色变为黄绿色，表明此阶段的幼胚已经不是最佳的生长状态。对种子进行幼胚剥离时，获得的种子呈干瘪状，使得剥胚过程困难且容易对幼胚造成伤害，因此授粉后20-24d的材料不适宜进行剥胚操作。剥离幼胚的时期以授粉后15-19d为宜。

表4 幼胚获得率Tab.4 Ratio of obtained immature embryo

2.3 愈伤组织诱导培养基的筛选

将材料11065杂交后剥离的幼胚放入不同愈伤组织诱导培养基中，培养1个月以后观察愈伤组织状态，统计绿色幼胚的愈伤组织诱导率。1-4号培养基愈伤组织诱导率分别为:27.78%、16.23%、42.86%和11.11%。结果表明，3号培养基中，幼胚长大形成肉眼能够观察到的愈伤组织比其他培养基中的愈伤组织多，并且愈伤组织形态好，颜色呈绿色(见图1)，能够进行继代培养或进行芽的分化培养。因此确定3号培养基为供试培养基中最适的愈伤组织诱导培养基。

图1 体视显微镜下种子观察及肉眼观察下的愈伤组织A:授粉后10-14d的种子;B:授粉后15-19d的种子; C:授粉后20-24d的种子;D:诱导出的愈伤组织Fig.1Seeds under stereomicroscope and callus by camera

3 讨论

试验中发现杂交蒴果的膨大受温度，光照，红花亚麻花粉质量等因素的影响。试验材料在温室或室外条件下盆栽种植，选择适宜的人工杂交时期，保证蒴果膨大率，能够获得较多的试验材料。为后续研究考虑，本研究采用栽培亚麻杂交F1代作为试验材料，这与米君等［6］利用宿根亚麻(Linum perenne)进行栽培亚麻种间杂交采用纯合材料的方式不同。栽培亚麻F1代材料的亲本不同，各材料间蒴果膨大率不同。

在进行幼胚剥离的操作时，有些种子形态较小，在体视显微镜视野下观察不到里面的幼胚。可以考虑不进行幼胚剥离处理，将种子直接放入愈伤组织诱导培养基中进行培养，待诱导出愈伤组织后，再进行剥离处理。此操作虽然诱导出愈伤组织较少且培养时间较长，但可以避免材料的浪费。

幼胚剥离时期的确定，需要考虑处理材料的难易程度以及剥离的幼胚数量，还应该考虑幼胚的生长状态对后期愈伤组织形成的影响。自然条件下幼胚败育，幼胚的活力是否影响后期的愈伤组织形成，可以就此进行深入的研究。

在胚挽救技术中，植物生长调节剂的种类、浓度和配比是研究的核心和关键［7］。配制胚挽救各阶段所需培养基时应综合考虑植物生长调节剂的使用。本研究中玉米素和NAA的配合使用及其浓度配比对愈伤组织诱导起着重要作用。后续的试验需要研究植物生长调节剂的浓度和配比对芽的诱导、伸长以及再生植株生根的影响，筛选最适培养基，完善胚挽救技术体系。

4 结论

研究对栽培亚麻与红花亚麻种间杂交以及形成的幼胚进行胚挽救研究。最适的幼胚剥离时期为授粉后15-19d。最适愈伤组织培养基为MS+0.1mg/L NAA+5 mg/L玉米素+15g/L蔗糖+15 g/L葡萄糖+0.8%琼脂，pH5.6。

［1］路颖.我国亚麻品种资源的分类和近缘野生种［J］.黑龙江农业科学，2009(4):46-47.

［2］程莉莉，黄文功.亚麻品种黑亚14号再生体系的优化［J］.中国麻业科学，2011，33(4):168-171.

［3］黄文功，关凤芝，吴广文，等.纤维亚麻新品种黑亚21号选育简报［J］.中国麻业科学，2012，34(2):74-75.

［4］戴华军，朱正斌，沈雪林，等.作物远缘杂交育种的途径及其实质［J］.基因组学与应用生物学，2010，29(1):144 -149.

［5］王丽，马晓娣，米君，等.栽培亚麻×野生亚麻种间杂交胚胎发育的研究［J］.河北农业大学学报，2007，30(5):19 -22.

［6］米君，李爱荣，钱合顺，等.亚麻种间杂交技术研究初报［J］.中国麻业科学，2008，30(3):136-146.

［7］吕雪，王丽娟，李春苗，等.李杏远缘杂交胚抢救体系的建立［J］.中国果树，2014(1):21-24.

Interspecific Hybridization and Immature Embryo Rescure between Linum usitatissimum and Linum grandiflorum

CHENG Li-li，GUAN Feng-zhi*，WU Guang-wen，YU Ying，HUANG Wen-gong，ZHAO Dong-sheng，YUAN Hong-mei，HOU Jia-xin
(Institute of Industrial Crops，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China)

In order to explore the application of wild flax in breeding，Linum usitatissimumandLinum grandiflorumwere used to study on interspeicific hybridization and embryo rescure.The analysis showed that the optimal embryo rescure stage was 15-19 days after pollination.Callus was obtained when immature embryo was cultured on the medium of MS+0.1mg/L NAA+5 mg/L zeatin+15g/L sucrose+15 g/L glucose+0.8%agar，pH5.6.The embryo rescure technology system was preliminarily established.This method laid a foundation for flax breeding withLinum grandiflorum.

flax;interspecific hybridization;embryo rescure

S563.2

A

1671-3532(2015)01-0001-04

2014-10-27

哈尔滨市科学技术局青年科技创新人才基金(2013RFQYJ020);黑龙江省农业科学院农业科技创新工程青年基金(2012QN010)

程莉莉(1983-)，女，硕士，助理研究员，从事亚麻遗传育种研究。E-mail:chenglili_i@163.com。

*通讯作者:关凤芝(1955-)，女，学士，研究员，从事亚麻遗传育种研究。E-mail:kj-gfz@163.com。