大麻雄性基因连锁AFLP分子标记的筛选及鉴定

郭丽，张海军，2，*，王明泽，车野，刘德泉，陈井生，刘德福，于吉东，吴耀坤

(1.黑龙江省农业科学院大庆分院，黑龙江大庆163316; 2.吉林省种子管理总站，长春130062; 3.吉林大学植物科学学院，长春130062)

大麻雄性基因连锁AFLP分子标记的筛选及鉴定

郭丽1，张海军1，2，3*，王明泽1，车野1，刘德泉3，陈井生1，刘德福1，于吉东1，吴耀坤1

(1.黑龙江省农业科学院大庆分院，黑龙江大庆163316; 2.吉林省种子管理总站，长春130062; 3.吉林大学植物科学学院，长春130062)

为建立一种大麻早期性别筛选及鉴定方法，利用AFLP标记技术，筛选了64对EcoRI-NNN/MseI-NNN引物组合，对11个不同大麻品种雌、雄植株的混合DNA池进行了性别连锁特异性条带的筛选。结果表明，6对引物组合表现出多态性，其中，EcoRI-ACA/MseICTG在雄性DNA池中扩增出1条特异条带，经各品种单株DNA验证，该条带只在雄性单株稳定出现，回收、克隆、测序后获得1条可用于大麻早期田间性别鉴定的734bp雄性特异条带。

大麻;雄性;AFLP;分子标记

大麻(Cannabis sativaL.)是古老工艺加工型纤维作物，雌雄同株新品种选育是当前研究热点［1］。大麻的性别分化受遗传物质控制和环境因素双重调控，即使培育出了雌雄同株大麻品种，性别也不稳定，因此，亟待对大麻性别分化及分子遗传机理进行深入研究［2］。国内外的研究学者已经发现了10多个雄性特异条带［3-10］和3个雌性特异条带［7］，并开发了若干个稳定的SCAR标记［4，6，9］。利用AFLP技术进行大麻品种鉴定及遗传多样性分析是可行的，其中，AFLP标记已经开始应用于大麻的司法鉴定检测工作［11-13］。本研究利用AFLP标记技术探究大麻性别连锁特异标记，旨在提高大麻的雌雄同株率。

1 材料与方法

1.1 供试植物材料

选用11个大麻品种:尤纱31、晋麻1号、云麻1～4号、皖大麻1～2号、庆麻001、庆麻003、肇州大麻。试验材料2013年种植于大庆大麻试验站红旗泡试验基地，随机区组试验设计，3次重复。

1.2 供试试剂及仪器

限制性内切酶、T4连接酶、Taq酶、接头和引物等购自或合成于北京鼎国公司。MseI接头: 5'-GACGATGAGTCCTGAG-3'，3'-TACTCAGGACTCAT-5';EcoRI接头:5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'，3'-CATCTGACGCATGGTTAA-5'。MseI预扩引物:5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3';EcoRI预扩引物:5'-GACTGCGTACCAATTC-3'。选择性扩增引物:EcoRI-AAC、EcoRIAAG、EcoRI-ACA、EcoRI-ACT、EcoRI-ACC、EcoRI-ACG、EcoRI-AGC和EcoRI-AGG; MseI-CAA、MseI-CAC、MseI-CAG、MseI-CAT、MseI-CTA、MseI-CTC、MseI-CTG和MseI-CTT。FA-2004A型分析天平、低温高速离心机、恒温水浴锅、核酸蛋白定量仪、电泳仪、PCR扩增仪、连接仪、垂直板电泳系统及凝胶成像系统等。

1.3 基因组DNA提取及DNA池的构建

待肉眼鉴定雌、雄植株后，雌雄株各随机选取5株，每株取幼嫩叶片约500mg置于1.5 mL离心管，构成混合DNA池，液氮速冻后置于-20℃保存备用。基因组DNA提取参照顾红雅等［14］的SDS法，加以改良，在SDS裂解液中加入β-巯基乙醇(8μL/mL)和3%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。试验均采取3次生物学重复，提取的DNA置于TE缓冲液中，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后-20℃保存。

1.4 AFLP分析

参照Vos等［15］的方法，略作调整。分步法酶切体系:100ngDNA 5.0μL、10×TangoTm Buffer 4μL、100U/μL EcoRI 0.5μL，100U/μL MseI 0.5μL，ddH2O补齐20μL。37℃3h，65℃0.5h，80℃20min，冷冻2min，-20℃保存，取5.0μL检测。连接体系:酶切产物20μL、MseI接头2.0μL、EcoRI接头2.0μL、T4连接酶1.0μL、10×T4连接酶Buffer 4.0μL，ddH2O补齐40μL。恒温16℃置于连接仪中过夜。预扩增体系:连接产物稀释10倍(5μL)、10×PCR缓冲液2.0μL、MseI引物1.0μL、EcoRI引物1.0μL、Taq酶0.25μL，ddH2O补齐20μL;PCR程序: 94℃2min，94℃20s，56℃30s，20个循环后60℃30min。选择性扩增体系:预扩产物稀释50倍(5.0μL)、10×PCR缓冲液2.0μL、dNTP 1.6μL、Taq酶0.25μL、MseI、EcoRI选扩引物各0.5μL，ddH2O补齐20μL。选择性扩增用梯度PCR，条件:94℃2min;94℃30s，65℃1min，72℃1min，12个循环，每循环降0.7℃;94℃30s，56℃1min，72℃1min，23个循环，4℃保存。

1.5 AFLP扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染

聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染参照王英［16］的方法。选择性扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺28.5g，N-N-亚甲基双丙烯酰胺1.5g，10×TBE 25mL，尿素210.2g，终体积500mL)中电泳分离，电泳缓冲液1×TBE，60W预电泳30min后，扩增产物加入等将扩增产物加入等体积的上样缓冲液(98%甲酰胺，10mmoL/L EDTA，0.25%溴酚蓝)，95℃变性5min后，立即转移至冰浴中冷却，每个样品取8μL上样，60W电泳2.5h。电泳结束后分开平板和凹板，进行PCR扩增产物银染，自然干燥保存。

1.6 特异片段的回收、克隆及测序

用Omega公司回收试剂盒切胶回收特异条带，以回收产物为模板，MseI-NNN/EcoRINNN为引物进行PCR再扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增片段与特异条带大小一致片段与pMD18-T载体连接，16℃连接仪中反应过夜，连接产物转化大肠杆菌，将提取的重组质粒进行双酶切鉴定，37℃下酶切反应4.0h，琼脂糖凝胶电泳检测是否含目的片段。将PCR鉴定呈阳性的单克隆质粒测序，NCBI比对。

2 结果与分析

2.1 提取的大麻基因组DNA琼脂糖电泳结果

经紫外分光光度计测定，提取基因组DNA的A260/A280值在1.643～1.975之间，都比较接近于1.8，说明DNA样品纯度较好，酚类、多糖、蛋白质及色素等杂质去除较干净，适宜AFLP后续操作。2.2引物的筛选结果

64对选择性引物对11个大麻品种雌、雄植株混合DNA池进行性别连锁特异性条带筛选，部分聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图2，其中多态性组合6对:MseI-ACG/EcoRI-CTT、MseIAGC/EcoRI-CAC、MseI-ACA/EcoRI-CTG、MseI-ACC/EcoRI-CTG、MseI-ACT/EcoRI -CTA、MseI-AGC/EcoRI-CTA。雌雄单株DNA PCR验证结果表明，MseI-ACA/EcoRICTG组合雄性连锁，初步鉴定为雄性基因连锁AFLP标记。

图1 部分引物组合在雌、雄性DNA池中的扩增结果Fig.1PAGE electrophoresis of some pairs of AFLP markers in male and female DNA pools

图2 引物组合MseI-ACA/EcoRI-CTG在11个大麻品种中的聚丙烯酰胺凝胶电泳扩增结果Fig.2 PAGE electrophoresis of MseI-ACA/EcoRI-CTG amplification in eleven individuals of Cannabis sativa L.

2.3 特异条带的回收、克隆及测序结果

回收引物组合MseI-ACA/EcoRI-CTG的特异条带，PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条雄性特异条带(如图3)，与pMD18-T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌，提取重组质粒进行双酶切鉴定，阳性克隆里含有目的片段。测序结果表明，所获得的大麻雄性连锁AFLP片段大小为734bp。

图3 特异条带再扩增的琼脂糖凝胶电泳结果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of reamplification product of male-linked AFLP marker

3 结论

本研究利用AFLP分子标记技术，筛选出6对多态性引物，EcoRI-ACA/MseI-CTG在雄性DNA池中扩增出1条734bp雄性特异条带，经各品种雌、雄单株验证，该条带只可在雄性单株中稳定出现，该标记可用于大麻早期田间性别鉴定。

［1］陈美霞，祁建民，刘伟，等.麻类作物分子育种的研究现状与展望［J］.福建农业学报，2002，27(7):780-786.

［2］Welsh J，McClelland M.Finger printing genomes using PCR with arbitrary primers［J］.Nucleic Acids Res，1990，18，7213 -7218.

［3］Sakamoto K，Shimomura K，Komeda Y，et al.A male-associated DNA sequence in a dioecious plantCannabis sativaL.［J］.Plant Cell Physiol，1995，36(8):1549-1554.

［4］Mandolino G，Carboni A，Forapani S，et al.Identification of DNA markers linked to the male sex in dioecious hemp(Cannabis sativaL.)［J］.Theor Appl Genet，1999，98(1):86-92.

［5］Mandolino G，Carboni A，Bagatta M，et al.Occurrence and frequency of putatively Y chromosome linked DNA markers inCannabis satlivaL.［J］.Euphytica，2002，126(2):211-218.

［6］陈其军，韩玉珍，傅永福，等.大麻性别的RAPD和SCAR分子标记［J］.植物生理学报，2001，27(2):173-178.

［7］Flachowsky H，Schumann E，Weber W E，et al.Application of AFLP for the detection of sex-specific markers in hemp［J］.Plant Breed，2001，120(4):305-309.

［8］Peil A，Flachowsky H，Schumann E，et al.Sex-linked AFLP markers indicate a pseudoautosomal region in hemp(Cannabis sativaL.)［J］.Theor Appl Genet，2003，107(1):102-109.

［9］Moliterni V M C，Cattivelli L，Ranalli P，et al.The sexual differentiation ofCannabis sativaL.:A morphological and molecular study［J］.Euphytica，2004，140(1-2):95-106.

［10］吕佳淑，赵立宁，臧巩固，等.大麻性别相关AFLP分子标记筛选［J］.湖南农业大学学报(自然科学版)，2010，36 (2):123-127.

［11］Shannon L，George D W.Genetic variation in hemp and marijuana(Cannabis sativaL.)according to amplified fragment length polymorphiams［J］.Journal of Forensic Sciences，2006，51(2):371-375.

［12］路帆，程宝文，李虹，等.AFLP技术鉴别罂粟、虞美人和大麻种属差异的初步研究［J］.中国法医学杂志，2008，23(3):157-160.

［13］郭佳，裴黎，彭建雄，等.利用AFLP检测大麻遗传多样性［J］.中国法医学，2008，24(5):330-332.

［14］顾红雅，瞿礼嘉，明小天，等.植物基因与分子操作［M］.北京:北京大学出版社，1995，19.

［15］Vos P.，Hogers R.，Bleeker M.，et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting［J］.Nucleic Acids Res，1995，23: 4407-4414.

［16］王英.大豆生育期结构性状的遗传分析及相关基因的分子标记［D］.北京:中国农业科学院，2008.

Screening and Identification of AFLP Markers Linked to Male Gene in Cannabis sativa L.

GUO Li1，ZHANG Hai-jun1，2，3*，WANG Ming-ze1，CHE Ye1，LIU De-quan3，CHEN Jing-sheng1，LIU De-fu1，YU Ji-dong1，WU Yao-kun1
(1.Daqing Branches of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Daqing 163316，China; 2.Seed Management Station of Jilin Province，Changchun 130062，China; 3.College of Plant Science，Jilin University，Changchun 130062，China)

64 pairs of AFLP primer combinations of 8 pairs of EcoRI-NNN and MseI-NNN primers were used to find the polymorphisms between mixed DNA pools ofCannabis sativaL.varieties.Six pairs of sixty-four primer combinations showed polymorphism between male and female DNA pools.700bp specific fragments were amplified in the primer combination of EcoRI-ACA and MseI-CTG in male DNA pool.This marker was testified with individual DNA of 11 varieties，and the fragment could only be amplified in male plants.The male-specific fragment of 734bp was recovered，cloned and sequenced.

Cannabis sativaL.;male;AFLP(Amplified fragment length polymorphism);molecular marker

S563.3

A

1671-3532(2015)01-0005-04

2014-09-05

国家麻类产业技术体系项目(CARS-19-S04);黑龙江省农业科技创新工程重点(青年基金项目)(2012QN002)

郭丽(1981-)，女，助理研究员，从事亚麻、大麻等经济作物新品种选育工作。E-mail:guoli1981W@sina.com。

*通讯作者:张海军(1986-)，男，农艺师，从事新品种选育和技术推广工作。E-mail:zhanghaijun.234@163.com。