亚麻与黄麻沤麻池的细菌生物多样性分析

张兴群，原月梦，孔德枝，郁崇文，3，金关荣，傅佳佳，丁若垚，3*

(1.东华大学纺织面料技术教育部重点实验室，上海201620; 2.东华大学生态纺织教育部重点实验室，上海201620; 3.东华大学纺织学院，上海201620; 4.浙江省农业科学院萧山棉麻研究所，杭州311202; 5.江南大学生态纺织教育部重点实验室，江苏无锡214122)

亚麻与黄麻沤麻池的细菌生物多样性分析

张兴群1，2，原月梦1，2，孔德枝1，2，郁崇文1，2，3，金关荣4，傅佳佳5，丁若垚1，2，3*

(1.东华大学纺织面料技术教育部重点实验室，上海201620; 2.东华大学生态纺织教育部重点实验室，上海201620; 3.东华大学纺织学院，上海201620; 4.浙江省农业科学院萧山棉麻研究所，杭州311202; 5.江南大学生态纺织教育部重点实验室，江苏无锡214122)

本研究以亚麻与黄麻两用沤麻池中的沤麻液为研究对象，取样后富集培养分离得到9株脱胶细菌，通过传统微生物学研究手段与分子生物学系统发育分析相结合的方法进行生物多样性研究。研究结果表明:9种细菌分别聚类为产碱菌属(Alcaligenessp.)4株，芽孢杆菌属(Bacillussp.)4株，寡氧单胞菌属(Stenotrophomonassp.)1株。系统发育分析发现9种细菌从亲缘关系上较为接近单胞菌属Stenotrophomonassp.，假单胞菌属Pseudomonassp.和芽孢杆菌属Bacillussp.。这三类菌属也是目前已知细菌中较为常见的脱胶菌属。说明该9种细菌与脱胶菌属关系较近，具有进一步研究的可能。

亚麻;黄麻;沤麻;细菌;生物多样性

麻类制品以其良好的吸湿透气性能及抗菌能力，长期以来一直受到广大消费者的喜爱。亚麻纤维天然古朴、色彩柔和，具有独特的凉爽舒适性，是化学纤维所不具备的，被誉为“植物纤维中的皇后”［1］。黄麻是我国重要的经济作物，是价格便宜、富有韧性、极易吸湿散湿、抗菌的天然纤维素纤维，能很好的与棉花、羊毛、粘胶及其它纤维混纺［2］。

亚麻与黄麻在纺织生产前需要通过一种沤麻过程来预先处理部分胶质［3］。沤麻过程实际上应用到了传统的微生物技术，它是一个通过微生物分泌的复合酶系协同降解附着在纤维表面非纤维素胶质的过程。原麻收获之后，被放置于空旷处或水中大约2至3周。在这段时间内，细菌慢慢地降解果胶物质并从植物组织中剥离出纤维，同时使纤维软化，沤麻过程对麻纤维质量有很大影响［4］。

国内外对沤麻脱胶菌种进行了广泛的研究，并取得了一系列的研究成果。人们早在上世纪50年代就发现某些细菌(如芽孢杆菌属Bacillussp.等)有脱胶释放纤维的能力［5］。Jauneau A.等将水解果胶的微生物群落中发现的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生的果胶裂解酶应用于亚麻的浸渍脱胶(沤麻)［6］。几十年来人们经过大量的试验筛选出了一系列的高效韧皮纤维脱胶菌株，如:Aspergillus versicolo，Erwiniasp.，Amycolatasp.，Clostridium felsineum和Bacillussp.等等，应用范围几乎包括所有麻类:亚麻、黄麻、苎麻、红麻、大麻等［7］。

沤麻过程的菌种选择是沤麻的关键。但是人们对沤麻环境中的细菌群落构成尚没有一个全面的认识，因此，对沤麻池中的细菌生物多样性进行研究，对筛选脱胶优势菌种具有重要的指导意义。传统的微生物分离鉴定方法存在一定的局限性，这阻碍了人们对于微生物多样性的研究。特别是不能对那些特殊环境下生长的微生物，进行有效的分类，影响了鉴定结果的可靠性。现代分子生物学的快速发展，为物种鉴定提供了更加真实可靠的检测方法。本文以亚麻与黄麻两用沤麻池中的沤麻液为研究对象，采用形态及生理生化特征与分子生物学结合的方法对其中存在的具有生物脱胶能力的细菌进行分类鉴定，以期对沤麻过程中的细菌群落有进一步的认识和了解，为进一步构建沤麻生物脱胶菌株体系提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

细菌样品来源:浙江省农业科学院萧山棉麻研究所的亚麻与黄麻两用沤麻池。采样时间为2013年11-12月之间(沤麻后期)。取土壤样品于沤麻池底部土壤中央位置。采集表层下深度为10-15 cm的3个供试土壤样品，混匀后置无菌密封袋中备用。-20℃保存。

亚麻与黄麻材料来源:亚麻由黑龙江省农科院经济作物研究所提供，黄麻由浙江省农业科学院萧山棉麻研究所提供，均收获于2013年秋天。

主要实验设备如下:COVER-015显微镜(OLYMPUS)，PCR扩增仪(美国应用生物公司)，DYCP-33A型电泳槽(北京六一仪器厂)，DYY-6B型电泳仪(北京六一仪器厂)，紫外凝胶成像仪Tamon 3500(上海天能科技有限公司)，隔水式电热恒温培养箱GHP-9080(上海齐欣医疗器械有限公司)，DK-8D电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)，生物洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗仪器厂)，高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，HITACHI CR21GⅡ高速离心机(Hitanhi Koki)，大容量全温振荡培养箱DQHZ-2001B型(太仓市华美生化仪器厂)，YXQ-LS-50SI立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，电热恒温鼓风干燥箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司)。

主要生物试剂配置如下。富集培养基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.4～7.6。分离培养基:K2HPO41g，MgSO40.5g，亚麻粉2.5g，黄麻粉2.5g，(NH4)2SO45g，KCl 0.5g，FeSO40.05g，琼脂20g，水1000mL，pH 7.0-7.2。保藏培养基:蛋白胨5g，牛肉膏30g，NaCl 5g，琼脂20g(固体培养基才添加)，蒸馏水定容至1000mL，调节pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min。淀粉培养基:蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000mL，琼脂15-20g，121℃灭菌20min。明胶培养基:牛肉膏蛋白胨液100mL，明胶12-18g，pH 7.2-7.4，溶化后调pH 7.2-7.4，121℃灭菌20min。油脂培养基:蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，香油10g，1.6%中性红水溶液1mL，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的富集与分离纯化

将样品按质量比1:20分别置于盛有500 mL富集培养基的1000 mL锥形瓶中，室温静置富集一周，将富集液梯度稀释107倍，取200 μL分别涂布于分离培养基固体平板上，30℃培养，待菌落长出后，挑取形态上有差别的单一菌落，碱性美兰染色鉴别后挑取单菌落，反复划线纯化得到纯培养［8］。

1.2.2 细菌的形态与生理生化鉴定

在保藏培养基上观察菌落形态，采用碱性美兰染色方法在光学显微镜下观察菌种形态与芽孢结构，具体方法参照文献［8］，将分离的菌株进行初步分类。参照文献对细菌菌株进行生理生化实验，包括淀粉水解、硝酸盐还原、明胶液化、柠檬酸盐利用试验等［9］。

1.2.3 细菌16SrDNA序列的测序与分析

将细菌接种于保藏培养基(液体)中，在37℃，150rpm条件下，摇床培养24小时以上。接着用DNA提取试剂盒(上海生工生物技术公司)提取细菌DNA，再以得到的DNA为模板，进行PCR(聚合酶链式反应)体外扩增。

其中PCR体系(单倍):

Taq酶(TaKaRa 5U/μL)0.25μL 10×PCR Buffer(TaKaRa Mg2+Plus)5μL dNTP Mixture(TaKaRa各2.5mM)4μL引物1、2(上海申能博彩)2μL模板DNA2.5ng，约合2μL补加无菌蒸馏水至50μL上样缓冲液、Marker均出自TaKaRa公司

PCR产物送交上海生工生物技术公司测序。将测得的16SrDNA基因序列在NCBI中的Gen-Bank数据库中进行BLAST比对。

1.2.4 系统发育树构建与分析

用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(version 4)对细菌菌种进行系统发育聚类分析(菌株的16SrDNA全序列)，得到系统发育进化树。该菌种系统进化树包含了本次研究筛选到的细菌菌种与在NCBI中的GenBank数据库中以往文献中提到的沤麻池中的脱胶细菌菌属［10］。

2 结果与分析

2.1 分离细菌菌株的形态学与生理生态分析

利用分离培养基的筛选作用，经过富集培养基富集培养、菌种筛选、碱性美兰染色、镜检观察显微形态，最终得到9株细菌菌株，分别记作Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y7，Y8，Y9和Y11。经过筛选分得的9株菌株的菌落形态和显微形态如图1和图2，表1和表2所示。

如图1和图2所示，从沤麻液中分离的9株细菌菌落形态多为圆形隆起，且菌落颜色大部分为白色或乳白色。表面多为光滑有光泽，一部分粗糙无光泽，个别在表面有皱褶;显微形态表示大多数菌体细胞均为杆状，个别为球状。有1/2革兰氏染色呈阴性，有1/2细菌细胞带有芽孢。

细菌的生理生化特征如表3所示，其中Y1、Y2和Y3等三株菌的生理生化特征较为相近，其余种属都较为不一致，总体观察为不同细菌种属。2.2分离菌株16SrDNA系统发育分析

表1 亚麻与黄麻沤麻池中可培养细菌菌落形态Tab.1 Colony forms of bacteria from flax and jute retting pond

表2 亚麻与黄麻沤麻池中可培养细菌菌体形态Tab.2 Micro-characteristics of bacteria from flax and jute retting pond

表3 亚麻与黄麻沤麻池中可培养细菌生理生化特征Tab.3 Physiological and biochemical features of bacteria from flax and jute retting pond

图1 亚麻与黄麻沤麻池中可培养细菌显微镜照片Fig.1Microscope photos of bacteria from flax and jute retting pond

图2 亚麻与黄麻沤麻池中可培养细菌菌落照片Fig.2Photos of bacteria colony from flax and jute retting pond

2.2.1 细菌测序结果分析

提取初步分离的细菌总DNA序列，提取后的细菌总DNA送由上海生工生物工程有限公司进行细菌16SrDNA序列的测序。测序结果提交GenBank获得登录号，使用GenBank的Blast程序将9条序列与数据库中的序列进行比对，获得各条序列的同源性信息，结果见表4。9种细菌分别聚类为产碱菌属(Alcaligenessp.)4株，芽孢杆菌属(Bacillussp.)4株，寡氧单胞菌属(Stenotrophomonassp.)1株。其相似性均较高，仅Y7在95%，其余都在99%以上，可以确定大部分菌种与已知菌种属于同一种。进一步利用形态观察和生理生化反应对9株细菌纯培养物进行鉴定，得到如下结果:Y1、Y7属于粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，Y2、Y3属于产碱菌属(Alcaligenessp.)，Y4、Y11属于赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillussp.)，Y5属于米氏硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus migulanus)，Y8属于苏云金芽孢杆菌属(Bacillus thuringiensis)，Y9属于微嗜酸寡氧单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)。

图3 亚麻与黄麻沤麻池中可培养细菌的系统发育进化树Fig.3Phylogenetictree of bacteria from flax and jute retting pond

2.2.2 16SrDNA序列的系统发育分析

为显示分离菌与已知菌的亲缘关系及其种属地位，利用GenBank数据库中亲缘关系最近的可培养细菌，部分已知脱胶菌属与9株分离菌的序列构建系统发育进化树，如图3所示。

表4 亚麻与黄麻沤麻池中可培养细菌16SrDNA序列的BLAST结果Tab.4 BLAST result of 16SrDNA sequences of bacteria from flax and jute retting pond

从系统发育进化树中可以发现:Y4与Y8，Y3与Y7、Y11以及Y1、Y9与Y5和Y2这三组细菌的群落关系较为接近。所有9种细菌从亲缘关系上较为接近单胞菌属Stenotrophomonassp.，假单胞菌属Pseudomonassp.和芽孢杆菌属Bacillus sp.。这三类菌属也是目前已知细菌中较为常见的脱胶菌属。说明该9种细菌与脱胶菌属关系较近，具有进一步研究的可能。

3 小结与讨论

3.1本研究利用分离培养基的筛选作用，经过富集培养基富集培养、菌种筛选、碱性美兰染色、镜检观察显微形态，最终得到9株细菌菌株，分别记作Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y7，Y8，Y9和Y11。9种细菌具有不同的菌落形态，显微形态和生理生化特征。

3.216 SrDNA测序分析结果表明:9种细菌分别聚类为产碱菌属(Alcaligenessp.)4株，芽孢杆菌属(Bacillussp.)4株，寡氧单胞菌属(Stenotrophomonassp.)1株。Y1、Y7属于粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，Y2、Y3属于产碱菌属(Alcaligenessp.)，Y4、Y11属于赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillussp.)，Y5属于米氏硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus migulanus)，Y8属于苏云金芽孢杆菌属(Bacillus thuringiensis)，Y9属于微嗜酸寡氧单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)。

3.3系统发育分析表明:Y4与Y8，Y3与Y7、Y11以及Y1、Y9与Y5和Y2这三组细菌的群落关系较为接近。所有9种细菌从亲缘关系上较为接近单胞菌属Stenotrophomonassp.，假单胞菌属Pseudomonassp.和芽孢杆菌属Bacillussp.。这三类菌属也是目前已知细菌中较为常见的脱胶菌属。说明该9种细菌与脱胶菌属关系较近，具有进一步研究的可能。

3.4目前国内对于苎麻系统中脱胶微生物的分离鉴定，进行了大量的研究，但是关于亚麻与黄麻沤麻体系中存在的脱胶微生物种类却鲜有报道。这类两用沤麻体系中新的脱胶微生物的菌种研究仍有很大的研究空间。通过研究亚麻与黄麻沤麻池中的细菌群落多样性，为后续从中选出优势脱胶新菌株奠定了理论基础。

［1］丁若垚.亚麻粗纱脱胶微生物的选育与应用［D］.上海:东华大学，2013.

［2］金关荣，傅福道，邹清成，等.制约黄、红麻纤维生产发展的主要因素与对策［J］.中国麻业科学，2008，(1):48-53.

［3］孙庆祥.麻类作物的微生物脱胶(综述)［J］.中国麻作，1981，(1):38-41.

［4］刘正初，彭源德，孙庆祥.黄麻和红麻脱胶的影响因素研究［J］.中国农业科学，1995，28(3):28-34.

［5］陈杨栋.苎麻纤维天然处理体系的微生态解析［D］.上海:东华大学，2010.

［6］陈杨栋，陈婷，李力炯，等.几种苎麻园土壤微生物总DNA提取方法比较［J］.实验室研究与探索，2010，(4):17-20.

［7］Yu H，Yu C.Study on microbe retting of kenaf fiber［J］.Enzyme and microbial technology，2007，40(7):1806-1809.

［8］布坎南R·E，吉布斯N·E.伯杰细菌鉴定手册［M］.8版.北京:科学出版社，1984.

［9］东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京:科学出版社，2001.

［10］杨永华，姚健.分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用［J］.生物多样性，2000，8(3):337-342.

Analysis On Bacteria Biodiversity in Flax and Jute Retting Pond

ZHANG Xing-qun1，2，YUAN Yue-meng1，2，KONG De-zhi1，2，YU Chong-wen1，2，3，JIN Guan-rong4，FU Jia-jia5，DING Ruo-yao1，2，3*
(1.Key Laboratory of Textile Science＆Technology，Ministry of Education，Shanghai 201620，China; 2.Key Laboratory of Science＆Technology of Eco-Textile，Ministry of Education，Shanghai 201620，China;3.College of Textiles，Donghua University，Shanghai 201620，China; 4.Cotton and Fiber Institute of Xiaoshan of Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 311202，China;5.Key Laboratory of Science＆Technology of Eco-Textile，Ministry of Education，Wuxi 214122，China)

In this study，bacteria strains isolated from flax and jute retting pond were studied.Traditional microbiology method and molecular biology method were used to analyze bacteria biodiversity.The results showed that 9 isolated strains of bacteria belong to members of 3 genuses that four strains are classified intoAlcaligenessp.，four strains are classified intoBacillussp.and one strain are classified intoStenotrophomonassp..Phylogenetic analysis showed that all these strains are close toStenotroph-omonas sp.，Pseudomonassp.andBacillussp.which were recognized as degumming bacteria in genetic relationship.

flax;jute;retting;bacteria;biodiversity

S154.38+1

A

1671-3532(2015)01-0014-07

2014-09-24

中国博士后科学基金面上资助(2014M561386);国家麻类产业技术体系建设专项资金资助项目(CARS-19);国家自然科学基金项目(31201134);江苏省基础研究计划青年基金项目(BK2012112);东华大学中央高校基本科研业务费专项资金(14D110524);大学生“小平科技创新团队”(麻类纤维生物脱胶技术产业化集成研发团队)

张兴群(1963-)，男，副教授。研究方向:工业微生物。E-mail:xqz@dhu.edu.cn。

*通讯作者:丁若垚(1986-)，男，博士，研究方向:纺织微生物。E-mail:dingruoyao@dhu.edu.cn。