工业大麻高效再生体系的初步研究

姜颖，夏尊民，韩承伟，李秋芝，赵越，曹洪勋

(黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆163319)

大麻 (Cannabis Sativa L.)，是大麻科 (Cannabinaceae)大麻属 (Cannabis)一年生草本植物，大麻又分为工业用大麻和毒品大麻，现在国内外广泛应用的大麻为工业用大麻，工业用大麻是指大麻中的大麻酚物质中的四氢大麻酚 (THC)含量低于0.3%的大麻[1－2]。工业大麻浑身是宝，具有较高的应用价值，如工业大麻籽就具有很好的药用价值和商业价值[3];近年来，随着人们回归自然，更加重视环保和健康等理念，对工业大麻的产品特性有了深入的了解，世界各国对工业大麻资源的利用与开发越来越重视。

目前，国内工业大麻品种多数为自留自选的农家品种，品种混杂退化、纤维产量低、长麻率仅在10%左右。这导致农民收入及原料加工效益低，进而直接影响到工业大麻产业的振兴。工业大麻产业发展壮大的技术瓶颈是推广种植高纤、优质、低毒、高产、高抗新品种。我国工业大麻新品种选育主要采用引种、系选、杂交、杂种优势、物理诱变等育种方法，其存在周期长、田间选择难度大、抗源不足等问题。生物工程技术育种是创新工业大麻资源，培育优质新品种的先进技术。但工业大麻单倍体、多倍体和细胞工程育种研究在我国尚属空白。因此，工业大麻高效再生体系的建立对工业大麻的遗传转化、单倍体培养等具有重要意义，为工业大麻生物工程技术育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

龙麻一号

1.2 试验方法

1.2.1 种子消毒

挑选成熟、饱满、有光泽的工业大麻种子，先用75%的乙醇浸泡2min，然后用无菌蒸馏水冲洗3～4遍;再用5%的次氯酸钠溶液 (NaClO)浸泡处理 (C1)0min，(C2)10min，(C3)15min，(C4)20min，(C5)25min，无菌蒸馏水冲洗5遍，冲洗过程中不断搅动种子，充分清除残留的次氯酸钠:然后在无菌条件下浸泡16～24h，种皮吸水胀裂后，用无菌滤纸吸干种子表面液体，接种于MS(无激素)固体培养基 (以下所有培养基:琼脂0.8%，3%蔗糖，pH 5.8)上，每处理接种20粒种子，重复3次。在温度为24±1℃、光照强度1800～23001ux、16h光照/8h黑暗条件下培养10天之后 (随时观察)，此时实生苗大约长至3～5cm，统计各处理的种子发芽情况、污染情况及无菌苗状态。

1.2.2 愈伤组织的诱导

将萌发10天后的工业大麻实生苗的下胚轴 (切成0.5～0.8cm的小段)作为外植体，接种于不同激素组合的愈伤组织诱导培养基上，诱导愈伤组织形成，接种20块，设置3次重复，在温度为24±1℃、黑暗条件下培养，随时观察，培养20天后统计愈伤组织诱导率。

愈伤组织诱导培养基:(Y1)MS+1.0mg/L 6－BA+1.0mg/L NAA;(Y2)MS+1.0mg/L 6－BA+0.5mg/L NAA;(Y3)MS+2.0mg/L 6－BA+1.0mg/L NAA;(Y4)MS+2.0mg/L 6－BA+0.5mg/L NAA。

1.2.3 不定芽的分化

将下胚轴诱导出的愈伤组织转入不定芽分化培养基中，进行不定芽的分化，接种10块，设置3次重复，在温度为24±1℃、光照强度1800～23001ux、16h光照/8h黑暗条件下培养，继代频率为每两周一次，随时观察，培养30天后统计不定芽分化率。

不定芽分化培养基:(B1)MS+1.0mg/L KT+0.5mg/L NAA;(B2)MS+2.0mg/L KT+0.5mg/L NAA;(B3)MS+2.0mg/L 2，4－D;(B4)MS+2.0mg/L 2，4－D+1.0mg/LNAA。

1.2.4 生根培养

待不定芽长至2～3cm左右时，将其从基部切下，插入不同生根培养基中，相同培养条件下进行伸长和诱导生根，培养40天后统计生根率。

生根培养基:(S1)1/2MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L NAA;(S2)1/2MS+0.05mg/L IBA+0.05mg/L NAA;(S3)1/2MS+0.05mg/L IBA+0.1mg/L NAA;(S4)1/2MS+0.1mg/L IBA+0.05mg/L NAA。

1.3 统计方法

愈伤组织诱导率 (%)=(产生愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数)x100

不定芽分化率 (%)=(分化出不定芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织总数)x100

生根率 (%)=(生根的不定芽数/接种的不定芽总数)x100

试验数据采用SPSS分析软件和Excel 2007进行分析处理和制图。

2 结果与分析

2.1 不同处理时间对种子消毒的影响

研究采用5%的次氯酸钠溶液 (NaClO)作为消毒剂，种子接种前采用75%的乙醇结合次氯酸钠对种子进行消毒，设计的工业大麻种子灭菌处理的试验，结果表明:75%乙醇浸泡2min后，再用5%的次氯酸钠溶液 (NaClO)浸泡处理15min，出苗率达到91.97%，没有污染的情况而且无菌苗的生理状态很好，叶片舒展，挺拔，整齐。如表1所示 (种子发芽率为90.00% ±1.00%)。

表1 5%的次氯酸钠溶液 (NaClO)浸泡处理时间对种子消毒的影响Tab.1 Effect of 5%NaClO at different treatment time on hemp seed disinfection

2.2 最适愈伤组织诱导培养基的确定

将萌发10天后的工业大麻实生苗的下胚轴 (切成0.5～0.8cm的小段)作为外植体，在不同激素组合的愈伤组织诱导培养基下的愈伤组织诱导率的比较数据见表2。研究结果表明:Y2培养基 (MS+1.0mg/L 6－BA+0.5mg/L NAA)的愈伤组织诱导率最高 (91.67%)，且诱导愈伤组织时间最短，而且愈伤组织生长情况较好。

表2 不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响Tab.2 Effect of different plant growth regulators on the induction rate of callus

2.3 最适不定芽分化培养基的确定

将愈伤组织转入不同激素组合的不定芽分化培养基中继续培养，培养约10天后细胞团表面开始出现绿芽点，30天后达到分化高峰，并对不定芽分化率进行比较 (表3)。结果表明:B1培养基 (MS+1.0mg/L KT+0.5mg/L NAA)的不定芽分化率最高 (76.67%)，由此说明，2，4－D的使用可能会抑制工业大麻不定芽的分化，生长素NAA搭配适宜浓度的细胞分裂素KT对工业大麻下胚轴诱导的愈伤组织进行不定芽分化产生促进作用。

表3 不同植物生长调节剂对不定芽分化的影响Tab.3 Effect of different plant growth regulators on differentiation rate of adventitious bud

2.4 不同激素组合对生根的影响

待不定芽长至2～3cm左右时，将其从基部切下，插入不同生根培养基中，培养20天左右不定芽开始生根，培养40天后统计生根率。研究表明:不同激素组合对根的诱导率有较大影响，以1/2MS+0.05mg/L IBA+0.05mg/L NAA激素组合效果较好，根的诱导率达到75%(如图1所示)。

图1 不同激素组合对生根的影响Fig.1 Effect of different plant growth regulators on rooting

图2 工业大麻组织培养的研究过程Fig.2 The process of tissue culture of industrial hemp(Cannabis sativa L.)

3 结论与讨论

工业大麻离体培养过程中，无菌苗的获得是关键，选择适宜的消毒剂和处理时间，既有良好的除菌效果，大大降低了初始污染率，又获得了生长状态更好的实生苗[4]。NaClO会影响植物幼苗的生长，还可能促进体细胞胚胎的发生[5]。所以，工业大麻种子消毒选用75%乙醇浸泡2min后，再用5%的次氯酸钠溶液 (NaClO)浸泡处理15min。培养基是植物组织培养的物质基础，对国内外工业大麻再生体系的培养基做了统计发现:MS培养基是应用最广泛的培养基[4]。所以，本研究选用MS培养基作为基本培养基。植物生长调节剂用量虽然微小，但却是不可或缺的，它可以调节培养物的生长发育进程、分化方向和器官发生[6]。NAA是光谱型植物生长调节剂，有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根等作用。工业大麻新品种龙麻一号适合的再生条件为:1.0mg/L 6－BA和0.5mg/L NAA组合的愈伤组织诱导率最高，达到91.67%;1.0mg/L KT和0.5mg/L NAA组合较适合不定芽的分化，不定芽分化率达到76.67%;0.05mg/L IBA和0.05mg/L NAA激素组合生根能力较好，生根率达到75%。

[1]Janick J，whipkey A.Trends in new crops and new uses[M].Alexandria:ASHS Press，2002.

[2]Avico U，Pacifici R，Zuccaro P.Variations of tetrahydro－cannabinol content in Cannabis plants to distinguish the fiber－type from drugtype plants [J].Bull Narc，1985，37(4):6l一65.

[3]姜颖，韩承伟，李秋芝，等.工业大麻籽的开发利用[J].黑龙江科学，2014，5(2):6－7.

[4]姜颖，韩承伟，李秋芝，等.工业大麻 (工业大麻)组织培养的研究进展[J].安徽农业科学，2014，42(1):7－8.

[5]张利国，宋宪友，房郁妍，等.大麻新品种龙大麻一号再生体系初探 [J].中国麻类科学，2012，34(3):112－114.

[6]贾婉琪.亚麻高效再生体系优化及抗除草剂bar基因的遗传转化研究[D].湖南:中国农业科学院麻类研究所，2011.