三个苎麻脱胶高效菌种的生长条件优化

李琦，成莉凤，段盛文，冯湘沅，彭源德*

(1.中国农业科学院麻类研究所，长沙 410205；2.湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128)



三个苎麻脱胶高效菌种的生长条件优化

李琦1，2，成莉凤1，段盛文1，冯湘沅1，彭源德1*

(1.中国农业科学院麻类研究所，长沙 410205；2.湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128)

研究3个苎麻脱胶高效菌种的最佳生长培养条件。利用分光光度计，以菌液浊度OD600为指标，对苎麻脱胶高效菌种活化条件的主要参数(起始pH、接种量、培养温度和培养时间)进行研究。通过单因素和正交试验，获得3个苎麻脱胶高效菌种活化条件的最优组合。结果表明：Hn1-1菌种的最佳生长条件为起始pH 6.0、接种量5%、培养温度37℃、培养时间8 h；Hn2-2菌种的最佳生长条件为起始pH 8.0、接种量6%、培养温度30℃、培养时间7 h；Hn6-2菌种的最佳生长条件为起始pH 6.0、接种量7%、培养温度35℃、培养时间6 h。通过优化培养条件，3个菌种的种子液生物量提高到1.5～2.0倍，为其在苎麻脱胶的进一步应用提供科学依据。

脱胶菌种；生长条件；单因素试验；正交试验

苎麻原麻除含有大量纤维素外，还含有果胶(4%-8%)、半纤维素(12%-18%)等“胶质”成分[1]。无论利用麻纤维开发何种纺织产品，都必须经过“脱胶”，除去这些键合型非纤维素物质。传统的沤麻方法存在产品质量不稳定、劳动强度大、生产环境恶劣、不利于工业化生产等缺陷。化学脱胶方法存在成本高、能耗大、纤维制成率低、纤维品质受到损伤和环境污染重等突出问题。生物脱胶方法具有“高效、清洁、低成本”等优点，是现代麻类纤维提取的发展趋势[2]。

麻类生物脱胶有菌脱胶和酶脱胶。与酶法脱胶相比，菌脱胶以成本低廉的优势，获得了广泛的工业化应用[3-5]。已有研究显示：菌脱胶过程中，菌种的最终脱胶能力与前期的活化状态(生物量)密切相关[6-7]。本团队前期从特殊生境中采集土壤样品，通过苎麻原麻富集培养后，用选择培养基筛选到3个苎麻脱胶高效菌种。本研究拟对3个菌种的生长条件进行优化，提高前期菌种活化的种子液生物量，为进一步提高麻类生物脱胶效率提供科学依据。

1　材料与方法

1.1供试菌种

Hn1-1、Hn2-2和Hn6-2菌种均为中国农业科学院麻类研究所农产品加工微生物遗传改良与应用团队选育，中国农业科学院农产品加工微生物菌种保藏库保存。

1.2培养基

生长培养基：改良营养肉汤培养基配方[8]，其pH根据具体实验调整。

固体平板培养基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉2%。

保藏斜面培养基：葡萄糖0.5%、营养琼脂3.5%。

1.3主要仪器

分光光度计(DR-5000)购自美国HACH 公司；pH计(HI9025)购自意大利HANN公司；气浴摇床(RH-Q)、水浴摇床(THZ-82)购自中国荣华仪器公司；生化恒温培养箱(SPX-250B-Z)购自上海博讯实业有限公司。

1.4菌种活化流程

菌种活化流程参考文献[9]。根据各单因素试验和正交试验接种100 mL生长培养基，在相应培养温度下培养，到合适的培养时间取样(菌悬液)，测定OD600。

1.5生长培养条件优化

1.5.1单因素试验

分别以培养温度(28、30、35、37和40℃)、起始pH(5.0-9.0，间隔0.5)、接种量(1%-9%，间隔2%)和培养时间(4-10 h)为变量，固定其他生长培养条件，每组试验设置3个重复进行单因素试验，以培养第8 h的菌液测得OD600为指标选择最优水平[10]。

1.5.2正交试验

以单因素试验结果为基础，根据培养温度、起始pH、接种量和培养时间设计四因素三水平正交实验L9(34)(表1)[11]。每组试验设置3个重复，以OD600为衡量指标，结合极差分析和方差分析选择最佳生长培养条件组合。

表1生长培养条件L9(34)正交试验因素及水平

Tab.1Factors and levels for orthogonal array design L9(34)

组号因素A因素B因素C因素D111112122231333421235223162312731328321393321

注：因素A，起始pH；因素B，接种量；因素C，培养温度；因素D，培养时间。

1.6数据处理方法

利用统计学分析软件SAS 9.0进行方差分析。

2　结果与讨论

2.1单因素试验

2.1.1起始pH对菌种生长的影响

图1结果表明：Hn1-1、Hn2-2和Hn6-2菌种生长的适宜pH分别为6.5、7.5和6.0。

图1　起始pH对菌种生长的影响

2.1.2接种量对菌种生长的影响

图2结果表明：Hn1-1和Hn2-2菌种生长的适宜接种量均为5%；Hn6-2菌种生长的适宜接种量为6%。

图2　接种量对菌种生长的影响

2.1.3培养温度对菌种生长的影响

图3结果表明：Hn1-1和Hn6-2菌种生长的适宜温度均为35℃；Hn2-2菌种生长的适宜温度为30℃。

图3　培养温度对菌种生长的影响

2.1.4培养时间对菌种生长的影响

图4结果表明：Hn1-1、Hn2-2和Hn6-2菌种在培养8 h后，均达到稳定期。

图4　培养时间对菌种生长的影响

2.2正交试验

2.2.1Hn1-1菌种的最佳培养条件组合

在单因素试验的基础上，对起始pH、接种量、培养温度和培养时间进行正交试验。表2和表3的结果表明：①影响Hn1-1菌种生长的主次顺序为：D>C>B>A，即培养时间>培养温度>接种量>起始pH；②在选定条件下，最佳生长培养组合为A1B2C3D3，即：起始pH 6.0、接种量5%、培养温度37℃、培养时间8 h。

通过进一步验证，Hn1-1菌种在最佳条件下培养，生物量OD600最高，可达0.886，是最低设计组(OD600为0.496)的1.79倍。

表2Hn1-1菌种L9(34)生长条件正交试验的极差分析

Tab.2Range analysis on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn1-1 strain

组号因素A因素B因素C因素D平均OD60016.043360.49626.053570.65636.063780.81246.543580.75556.553760.61366.563370.55977.043770.57887.053380.73997.063560.520k10.6550.6100.5980.543k20.6420.6700.6440.598k30.6120.6300.6680.769R0.0420.0600.0700.226影响因素大小:D>C>B>A最优组合:A1B2C3D3

表3Hn1-1菌种L9(34)生长条件正交试验的方差分析

Tab.3Analysis of variance on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn1-1 strain

变异来源偏差平方和自由度方差F值Fa显著水平因素10.002820.0014F0.01(2,6)=10.925因素20.005520.0028F0.05(2,6)=5.143因素30.007520.00382.013F0.1(2,6)=3.463*因素40.083220.041622.277F0.25(2,6)=1.762***误差e0.002820.0014修正误差e0.011260.0019总和0.102

2.2.2Hn2-2菌种的最佳培养条件组合

在单因素试验的基础上，对起始pH、接种量、培养温度和培养时间进行正交试验。表4和表5的结果表明：①影响Hn2-2菌种生长的主次顺序为：C>D>B>A，即培养温度>培养时间>接种量>起始pH；②在选定条件下，最佳生长培养组合为A3B3C2D3，即：起始pH 8.0、接种量6%、培养温度30℃、培养时间7 h。

通过进一步验证，Hn2-2菌种在最佳条件下培养，生物量OD600最高，达0.923，是最低设计组(OD600为0.471)的1.96倍。

表4Hn2-2菌种L9(34)生长条件正交试验的极差分析

Tab.4Range analysis on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn2-2 strain

组号因素A因素B因素C因素D平均OD60017.042850.47127.053060.76837.063270.78747.543070.84457.553250.53767.562860.65578.043260.70088.052870.73698.063050.809k10.6750.6720.6210.606k20.6790.6800.8070.708k30.7480.7500.6750.789R0.0730.0790.1860.183影响因素大小:C>D>B>A最优组合:A3B3C2D3

表5Hn2-2菌种L9(34)生长条件正交试验的方差分析

Tab.5Analysis of variance on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn2-2 strain

变异来源偏差平方和自由度方差F值Fa显著水平因素10.010220.0051F0.01(2,6)=10.925因素20.011220.0056F0.05(2,6)=5.143因素30.055120.02765.244F0.1(2,6)=3.463**因素40.050620.02534.814F0.25(2,6)=1.762*误差e0.010220.0051修正误差e0.031660.0053总和0.137

2.2.3Hn6-2菌种的最佳培养条件组合

在单因素试验的基础上，对起始pH、接种量、培养温度和培养时间进行正交试验。表6和表7的结果表明：①影响Hn6-2菌种生长的主次顺序为：B>C>A>D，即接种量>培养温度>起始pH>培养时间；②在选定条件下，最佳生长培养组合为A2B3C2D1，即：起始pH 6.0、接种量7%、培养温度35℃、培养时间6 h。

通过进一步验证，Hn6-2菌种在最佳条件下培养，生物量OD600最高，达0.953，是最低设计组(OD600为0.570)的1.67倍。

表6Hn6-2菌种L9(34)生长条件正交试验的极差分析

Tab.6Range analysis on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn6-2 strain

组号因素A因素B因素C因素D平均OD60016.053360.62826.063570.70036.073780.66346.553580.65156.563760.65966.573370.70277.053770.57087.063380.68497.073560.717k10.6640.6160.6710.668k20.6710.6810.6890.656k30.6570.6940.6310.666R0.0140.0780.0590.011影响因素大小:B>C>A>D最优组合:A2B3C2D1

表7Hn6-2菌种L9(34)生长条件正交试验的方差分析

Tab.7Analysis of variance on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn2-2

变异来源偏差平方和自由度方差F值Fa显著水平因素10.000320.0001F0.01(2,6)=10.925因素20.010420.005246.897F0.05(2,6)=5.143***因素30.005420.002724.478F0.1(2,6)=3.463***因素40.000220.0001F0.25(2,6)=1.762误差e0.000220.0001修正误差e0.000760.0001总和0.016

3　讨论

微生物的生长繁殖除了取决于自身种属外，还与生态环境条件(营养成分、温度、pH等)有密切关系。温度是影响苎麻脱胶菌种生长最重要的因素之一。本研究的脱胶菌在温度为30-40℃下的生长量最大，与前人的研究结果一致[12-13]。从pH影响研究结果来看，3株苎麻脱胶菌对环境酸碱度都比较敏感，pH为中性或略微偏酸或偏碱的条件下生长最好，pH过高或过低都不利于脱胶菌的生长[14]。

4　结论

以菌悬液OD600值为指标，优化了3个苎麻脱胶高效菌种的生长培养条件，即：(1)Hn1-1菌种的最佳生长条件为起始pH 6.0、接种量5%、培养温度37℃、培养时间8 h；(2)Hn2-2菌种的最佳生长条件为起始pH 8.0、接种量6%、培养温度30℃、培养时间7 h；(3)Hn6-2菌种的最佳生长条件为起始pH 6.0、接种量7%、培养温度35℃、培养时间6 h。

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Optimization of the Culture Conditions for Three Efficient Strains Used in Ramie Bio-degumming

LI Qi1，2, CHENG Lifeng1, DUAN Shengwen1, FENG Xiangyuan1, PENG Yuande1*

(1. Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, China;2. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

The optimal culture conditions of three efficient strains used in ramie bio-degumming were researched. Cell suspension turbidity (optical density at 600 nm,OD600) was measured using spectrophotometer to investigate the optimal initial pH, inoculation amount, culture temperature and time of the activation conditions for efficient strain used in ramie bio-degumming. Using one-factor-at-a-time combined with orthogonal array design method, optimal combination of the activation conditions for the three aimed efficient strains were found. Results showed that Hn1-1 strain achieved the highest biomass with inoculation amount 5% in 8 h of incubation at initial pH 6.0 and 35.5℃, Hn2-2 strain achieved the highest biomass with inoculation amount 6% in 7 h of incubation at initial pH 8.0 and 30℃, and Hn6-2 strain achieved the highest biomass with inoculation amount 7% in 6 h of incubation at initial pH 6.0 and 35℃ in the given conditions. Therefore, it can provide scientific basis for further application in ramie degumming as for the three improved liquid biomass (as 1.5～2.0 folds as that of originalOD600) by optimizing the culture conditions.

bio-degumming strain; growth condition; one-factor-at-a-time test; orthogonal test

1671-3532(2016)04-0181-07

2016-07-03

中国农业科学院创新工程(No. ASTIP-IBFC)；湖南省自然科学基金(No. 2016jj3126)；现代农业产业技术体系建设专项 (No. CARS-19)

李琦(1983-)，男，博士研究生，研究方向：微生物及酶工程。E-mail：15007302343@139.com。

彭源德(1965-)，男，研究员，研究方向：农产品加工微生物遗传改良与应用。E-mail：ibfcpyd313@126.com。

S563.1

A