12个亚麻品种亲缘关系的SRAP分析

吴建忠，赵东升，黄文功，刘岩，于莹，姜卫东，赵茜，康庆华，程莉莉，袁红梅，吴广文，关凤芝*

(黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086)

1 前言

亚麻(Linum usitatissmum L.)是亚麻科(Linaceae)亚麻属(Linum)的一年生自花授粉草本纤维植物，已经有六七千年的栽培历史。亚麻是重要的经济作物，它既是当今世界第三大纤维作物，又是五大油料作物之一。我国亚麻资源丰富，大多栽培品种难以从形态上区分开，而亚麻资源是育种和生产的重要物质基础，因此需要建立一种简单、快速的鉴定方法。分子标记技术的广泛应用为亚麻的品种鉴定及品种的亲缘关系分析提供了有效途径。

SRAP(sequence－related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性)是目前比较理想的一种新型分子标记，与其他分子标记(RFLP、AFLP、SSR等)相比，具有技术简便 、快速高效 、费用低、污染小、共显性好、信息量丰富等优点，已成功应用于多种动植物的遗传多样性分析 、种质鉴定、遗传连锁图构建和比较基因组学等方面［1］。本试验采用SRAP技术，对12个亚麻品种的亲缘关系进行分析，以确定各个亚麻品种之间的遗传差异，为资源利用和亚麻遗传连锁图谱构建中亲本选配及选育提供分子生物学依据，同时对新引进品种SUZANNE的油纤用类型鉴定提供依据。

2 材料与方法

2.1 材料

供试的12份亚麻品种中有纤用亚麻9个，油用亚麻2个，未知类型1份，详细情况分别见表1。

表1 供试亚麻品种及来源Tab.1 The tested flax varieties and their origins

2.2 方法

2.2.1 DNA提取和浓度测定

采用已改进的CTAB法提取亚麻基因组DNA［2］。紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，置20℃冰箱保存备用。

2.2.2 SRAP反应体系

SRAP反应采用已经优化好的体系［3］，在20ul反应体系中模板75ng，25 ng/μL的上下游引物用量为70ng，Mg2+浓 度 为1.5mmol/L，dNTP浓 度 为0.40mmol/L，1.5U 的 TaqDNA 聚合酶。

2.2.3 PCR扩增条件

反应热循环程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min、35℃复性1 min、72℃延伸1 min、5次循环;94℃变性1 min、50℃复性1 min、72℃延伸1 min、循环35次;最后72℃延伸10 min;4℃保温20 h。

2.2.4 PCR产物的检测

用2%的琼脂糖凝胶分离SRAP的扩增产物，使用20W恒功率电泳1h，凝胶成像仪照相。

2.2.5 数据统计与分析

对清晰可辩的电泳条带全部采用人工读带的方式进行统计分析，按扩增条带有无记数，在相同的迁移位置上，当某一扩增带出现时，赋值为“1”，无带赋值为“0”，从而把图形资料转换成数据资料。根据Nei－li相似系数法(也称为Dice法)求得品种i和j之间得相似系数Sij:

其中 Ni表示品种i中的条带数目;Nj表示品种j的条带数目;Nij表示品种 i，j共有的条带数目。采用分析软件NTSYS对所得数据进行遗传相似性分析，据各材料间的遗传相似性系数用非加权类平均聚类方法(UPGMA)对其进行聚类分析［4］。

3 结果与分析

3.1 引物多态性筛选

选取对供试亚麻材料可以扩增出特异性谱带且重复性好的9对有效引物，见表2。

表2 用于SRAP分析的19对有效引物序列Tab.2 The sequences of 19 pairs of SRAP primers

3.2 亚麻SRAP扩增结果

3.2.1 DNA多态性分析

9对引物在12个亚麻品种中共扩增出1701条清晰稳定的条带(见表3)，其中593条为特异性条带，平均每对引物扩增出189条带，平均每对引物扩增出65.9条特异性条带，其多态率为34.9%。用2%的琼脂糖凝胶分离SRAP的扩增产物，多态性条带非常清晰，容易辨别。每对引物在12个亚麻材料中共可扩

，达225条(增出的条带数在124－225条之间，平均为189条。其中扩增出条带数最多的为 M2见图1)。

组合、扩增总带plified and poly表3 SRAP引物 数及多态性带数Tab.3 Total ammorphic fragment numbers and their according SRAP primers

图1 2%琼脂糖凝胶电泳分离12个亚麻品种的M2引物扩增结果Fig.1 The amplified bands of 12 flax varieties with M2 primers and separated by 2%agarose gel electrophoresis

3.2.2 亚麻品种的聚类分析

对12个亚麻品种的SRAP分析结果进行UPGMA聚类(图2)，在遗传距离0.53时，可将12份材料分为三大类群，第Ⅰ大类包含:黑亚14号、双亚8号、SUZANNE、A220和H113，其中黑亚14号和双亚8号、A220和H113又各聚在一起，表明新引进品种SUZANNE与纤用亚麻有一定的亲缘关系，但和黑亚8号、黑亚14号又存在一定的差异度，因此可认为SUZANNE是一种新的纤维用亚麻品种;第Ⅱ大类中纤维用亚麻品种AGATHA、DIANE、ARIANE和黑亚20号聚在一起，表明这些材料亲缘关系较近;第Ⅲ大类将油用亚麻坝亚11号和宁亚17号聚在一起，且与YCH聚为一类，表明该类材料具有油用亚麻特性，可认为本类品种为油用亚麻或具有油用开发的潜力。

图2 基于UPGMA法构建的12个亚麻品种聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram of 12 flax varieties by UPGMA method

从聚类分析结果可以看出，纤用、油用亚麻各自聚类，表明它们之间的亲缘关系较远。故在品种间杂种优势利用时可以将纤用亚麻和油用亚麻作为亲本可以选育出理想的新型亚麻品种。同时，新引进品种SUZANNE和黑亚14号、双亚8号等纤维用亚麻的遗传距离较近，因此有理由认为SUZANNE是一纤维用品种，且其具有高纤开发的潜力，适合在杂种优势利用中作为高纤亲本进行选育。

4 讨论

本研究通过对12个不同亚麻品种进行SRAP分析，9对引物共扩增出593条多态性带，平均每个引物扩增出65.9条多态性带，其多态率为34.9%。用UPMGA法建立了12个亚麻品种的亲缘关系聚类图，以遗传距离0.53为阈值可将12个亚麻品种分为3组，油纤用品种各自成类，这就为新引进品种SUZANNE的类型划分提供了有力依据。本研究聚类分析的结果与品种的油纤用途类型基本吻合，充分证实了SRAP用于品种间遗传变异性分析的可行性，同时品种资源的遗传多样性研究不仅可以为新品种选育策略的制订提供依据，还可以为亲本选配、后代遗传变异程度及杂种优势水平的预测提供预见性指导。利用聚类分析结果可以快速、有效的进行亲本选配，减少盲目性，这对亚麻新品种的选育和杂交优势的利用具有很重要的意义。-本试验也进一步证实了SRAP标记的确具有引物设计和实验操作过程简单、扩增谱带清晰、多态性好和结果稳定的优点，为此。笔者下一步将继续利用SRAP技术对亚麻种质鉴定、遗传多样性分析以及纤维含量、出麻率等重要性状进行研究，旨在为亚麻种质材料筛选和新品种选育起到更多的辅助作用。

［1］Agarwal M ，Shrivastava N ，Padh H.Advances inmolecular marker techniques and their applications in plantsciences［J］.Plant Cell Reports，2008，27(4):617－631.

［2］吴建忠.亚麻全基因组DNA的提取及分析［J］.黑龙江农业科学，2011(07):18－19.

［3］吴建忠，黄文功，等.亚麻SRAP反应体系的优化和多态性标记筛选［J］.中国麻业科学，2011(06):281－284.

［4］Nei M，Li WH.Mathematical model for studyinggenetic variation in terms ofrestriction endonucleases［J］ .Proceedings ofthe National AcademyofSciences，1979，76:5269－5273.