沙拐枣甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析

房永雨，郝丽芬，聂利珍，丁海君，王力伟，赵小庆，孙 杰，史志丹，何江峰

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031；2.内蒙古自治区植物蛋白质组学重点实验室，内蒙古呼和浩特 010031）

沙拐枣（Calligonum mongolicum） 为蓼科（Polygonaceae）沙拐枣属（Calligonum）的一种灌木，主要分布于我国内蒙古中西部、甘肃西部以及新疆东部的干旱荒漠地区[1]。沙拐枣多生于沙地、沙砾质荒漠和砾质荒漠，是优良的防风固沙植物，具有生长快、易繁殖、耐沙埋、耐旱、抗风蚀的特点，多年生植株受到严重风蚀后，仍能正常开花结实[2]。沙拐枣的根系发达，经沙埋仍能迅速生成不定根，主根向下生长，侧根扩大；根系具有较厚的木栓组织，能有效保护输导组织；同时其绿色的同化枝具有发达的木质部，提高了在荒漠中的生存韧性。沙拐枣植物体内束缚水与自由水的比值较高，使植物具有较高的吸水和持水能力，原生质体处在高浓度环境中时，可提高植物细胞的黏滞性，增强植株的抗热和抗脱水能力[3]。因此，沙拐枣在保持组织水分、增强组织吸水和贮水能力方面有很大的优势，可以适应干旱、高温、风沙等多重胁迫。

甘氨酸甜菜碱（glycine betain，以下简称甜菜碱）是植物的重要渗透调节剂，在植物遇到盐碱、干旱、高温等逆境胁迫时，帮助植物细胞维持渗透平衡，并可保护蛋白酶活性，激活抗逆基因表达，提高植物的抗逆能力[4]。甜菜碱作为重要的植物抗逆物质，其合成途径是在胆碱单加氧酶的催化下以胆碱为底物生成甜菜碱醛，通过甜菜碱醛脱氢酶（BADH）的氧化生成甜菜碱[5]。甜菜碱醛脱氢酶是合成甜菜碱的关键蛋白酶。目前，已从互花米草[6]、刚毛柽柳[7]、胡杨[8]、碱蓬[9]、耐盐柳树[10]、盐节木[11]、海马齿[12]中克隆得到BADH 基因，将BADH 基因转入水稻[13]、马铃薯[14]、玉米[15]、棉花[16]、大豆[17]和番茄[18]等农作物，这些农作物的抗逆性得到不同程度的提高。但是并未见到有关沙拐枣完整BADH 基因的研究，鉴于沙拐枣对于干旱、高温、风沙的适应性，本试验从沙拐枣中克隆CmBADH 基因，并对其进行生物信息学分析，旨在为进一步利用沙拐枣CmBADH 基因的抗逆功能和解析其分子作用机制提供研究基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

沙拐枣种子采集于内蒙古阿拉善沙地，播种于直径为20 cm 的花盆中，基质为营养土和蛭石（5∶1），种植于内蒙古自治区农牧业科学院植物培养室内，培养温度25 ℃，光照/黑暗为16 h/8 h。培养30 d，干旱胁迫8 d，剪取嫩叶，液氮速冻，保存于-80 ℃，用于RNA 的提取。

1.2 试验试剂

总RNA 提取采用天根植物总RNA 提取试剂盒；反转录采用EasyScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；RACE 克隆采用SMARTer RACE 5′/3′ Ki（t大连TaKaRa 生物医药科技有限公司）；基因全长高保真克隆采用TransStartFastPfu DNA PolymerasePCR 试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；PCR 产物凝胶回收试剂盒、平末端克隆载体和大肠杆菌感受态采用EasyPurePCR Purification Kit、pEASY-Blunt Cloning Kit 和Trans1 -T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell 试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 试验方法

1.3.1 沙拐枣总RNA 的提取 液氮研磨的沙拐枣枝叶，按照天根植物总RNA 提取试剂盒说明书提取沙拐枣总RNA。使用Nanodrop 2000 检测其纯度和浓度，利用琼脂糖凝胶（1%）电泳检测其完整性。

1.3.2 沙拐枣cDNA 的合成 采用EasyScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix试剂盒获得cDNA。反转录体系为20 μL，包含总RNA（200 ng/μL）2 μL，Anchored Oligo（dT）Primer（0.5 μg/μL） 1 μL，2 ×ES Reaction Mix 10 μL，EasyScriptRT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover 1 μL，RNase-free Water 5 μL。反应程序为：42 ℃温育25 min，85 ℃灭活5 s，4 ℃保持。反应产物保存于-20 ℃冰箱，备用。

1.3.3 沙拐枣CmBADH 基因克隆与测序 根据前期沙拐枣转录组测序结果，得到BADH 基因的中间片段，以此为基础设计RACE 引物（表1）。5′和3′RACE -Ready cDNA 的 制 备 按 照 TaKaRa 的SMARTer RACE 5′/3′ Kit 说明进行。以5′ 和3′RACE-Ready cDNA 为模板，分别克隆5′和3′端序列，反应体系为50 μL：包含5′ 或3′RACE-Ready cDNA 2.5 μL，10×UPM 5 μL，5′或3′GSP 1 μL，2×SeqAmpTMBuffer 25 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 15.5 μL；反应程序：95 ℃，3 min；95 ℃，10 s，58 ℃，10 s，72 ℃，1 min，35 个循环；72 ℃，5 min；4 ℃保持。将扩增产物回收，连接到Blunt vector，转化大肠杆菌感受态Trans1-T1，涂布在含Kan 的LB 平板培养基上，37 ℃过夜培养。第2 天进行蓝白斑筛选，挑选阳性单斑进行菌斑PCR，验证正确后送北京华大六合基因测序。

表1 沙拐枣CmBADH 基因克隆引物

将5′和3′端序列进行拼接，设计CmBADH 基因全长引物（表1），反应体系50 μL：5× FastPfu Bufer 10.0 μL，BS 2 μL，BA 2 μL，cDNA 1 μL，dNTP（2.5 mM）1 μL，FastPfu DNA Polymerase 1μL，ddH2O 33 μL 反应程序：95 ℃，2 min；95 ℃，10 s，59 ℃，10 s，72 ℃，1 min，30 个循环；72 ℃，5 min；4 ℃保持。然后连接载体，转化大肠杆菌感受态进行测序，具体操作同上。

1.3.4 沙拐枣CmBADH 基因和蛋白的生物信息学分析 为了掌握沙拐枣CmBADH 基因和蛋白的序列信息，利用生物信息学分析软件对沙拐枣CmBADH 基因序列进行拼接，对蛋白序列进行如下分析：包括基本理化性质分析、磷酸化位点预测、跨膜结构域、亚细胞定位预测、信号肽位点预测、结构域分析、二级结构预测、三级结构建模、系统进化树构建（表2）。

表2 沙拐枣CmBADH 基因和蛋白生物信息学分析明细

2 结果与分析

2.1 沙拐枣CmBADH 基因的克隆

首先提取沙拐枣的总RNA，电泳结果显示总RNA 的28S、18S、5.8S 条带清晰完整（图1），可以进行反转录及后续试验研究。进一步通过RACE 技术克隆获得CmBADH 基因的5′和3′端片段（图2）。将电泳片段胶回收，转化大肠杆菌，进行测序，利用SeqMan 软件对测序序列进行拼接，得到CmBADH基因cDNA 的全长为1 863 bp，在NCBI 网站进行Blastn 比对，发现CmBADH 与海马齿（Sesuvium portulacastrum）、山谷栎（Quercus lobata）、盐爪爪（Kalidium foliatum） 的BADH 相似性分别达到80.04%、79.97%、79.55%，可以确认拼接得到了CmBADH 基因序列。

2.2 沙拐枣CmBADH 基因和蛋白的序列分析

利用TBtools 软件预测沙拐枣CmBADH 基因的开放阅读框（ORF）为1 506 bp，编码501 个氨基酸，将CDS 区与序列最相似的海马齿、栓皮栎、盐爪爪的BADH 基因的CDS 比对（图3），相似性达到87.55%。沙拐枣CmBADH 蛋白质中含有与醛脱氢酶高度保守的十肽VTLELGGKSP 结构，以及含有与酶功能有关的11 个半胱氨酸残基（图3）。

2.3 沙拐枣CmBADH 蛋白的理化性质及结构分析

利用Prot Param tool 在线软件预测，沙拐枣CmBADH 基因的相对分子量为123.46 kDa，等电点（pI）为5.01，不稳定指数［instability index（Ⅱ）］为44.24，属于稳定类型的蛋白。脂肪指数（aliphatic index）为26.49，GRAVY 为0.677，为弱疏水性蛋白。

利用Netphos3.1 分析磷酸化位点，发现该蛋白存在7 个丝氨酸（serine）磷酸化位点、4 个苏氨酸（threonine）磷酸化位点、5 个酪氨酸（tyrosine）磷酸化位点。

运用在线软件TMHMM Server 2.0 分析，发现编码区不含有跨膜结构域。运用PSORT Prediction分析发现，编码区蛋白定位到微体（microbody）的可能性为0.829，利用信号肽预测工具SignalP 5.0 分析发现，编码区蛋白不含有信号肽。

对沙拐枣CmBADH 蛋白结构域进行分析，发现含有一个甜菜碱醛脱氢酶结构域（PLN02467），其中含有NAD（P）结合位点，具有氧化还原酶活性（图4）。

利用SOPMA 分析编码区二级结构（图5），发现沙拐枣CmBADH基因的CDS 区α 螺旋含有217 aa，占43.31%；无规则卷曲含有160 aa，占31.94%；延伸链含有87 aa，占17.37%；β 转角含有37 aa，占7.38%。利用SWISS-MODEL 构建基因的CDS 区三级结构模型，其结构模型为椭球形（图6）。

2.4 沙拐枣CmBADH 蛋白序列的系统进化分析

从NCBI 下载CmBADH 蛋白的同源序列，利用MEGA7 软件的CLUSTER W 作同源序列比对，使用邻接法构建系统进化树，多序列比对和系统进化树结果显示（图7），沙拐枣的CmBADH 同刚毛柽柳（Tamarix hispida AIL24123.1）、火龙果（Hylocereus undatus），苋属的千穗谷（Amaranthus hypochondriacus）和三色苋（Amaranthus tricolor）的同源性较高。沙拐枣CmBADH 蛋白同油橄榄（Olea europaea XP022850208.1）、烟草（Nicotiana tabacum JQ654640.1）的同源性较低。

3 讨论与结论

BADH 基因是参与植物抗逆的关键基因，本研究结合二代测序结果，通过RACE 克隆技术，首次从沙拐枣中克隆出BADH 基因的cDNA 序列，并预测开放阅读框（ORF）为1 506 bp，编码501 个氨基酸。通过NCBI 数据库搜索和文献报道，目前已克隆得到的其他植物物种的BADH 基因的CDS 序列长度在1 494 ～1 521 bp[19]，本研究沙拐枣BADH 基因CDS 区的序列大小在此范围内。通过与相似物种的核苷酸序列比对发现（图3），CDS 序列5′端序列保守，而在3′端序列不保守，一是表现为长度不同，二是表现为终止密码子不同。

通过生物信息学分析预测沙拐枣CmBADH 蛋白共有16 个磷酸化位点；不含有跨膜结构域；不含有信号肽位点；在二级结构中α 螺旋和无规则卷曲是散布于该多肽链中的大量结构元件，以上结论与菠菜、山菠菜、辽宁碱蓬、玉米等BADH 基因的结果相同[19]。沙拐枣CmBADH 蛋白预测定位到微体中，且为弱疏水性蛋白，这与马铃薯、盐爪爪、菠菜、山菠菜、互花米草、辽宁碱蓬、玉米等物种的结果不同[19]，以上物种的BADH 蛋白为亲水性蛋白，定位到叶绿体和过氧化物酶体中[20]，推测BADH 蛋白的亲疏水性与亚细胞定位有关，但需深入研究。沙拐枣CmBADH 具有椭球形三级结构的蛋白，这与互花米草BADH 的结果相似[6]。系统进化树结果显示，沙拐枣CmBADH 与木本植物刚毛柽柳的同源性最高。沙拐枣CmBADH 蛋白中含有甜菜碱醛脱氢酶结构域（图4），且含有醛脱氢酶高度保守的十肽VTLELGGKSP 以及多个与酶功能有关的半胱氨酸残基（图3），符合醛脱氢酶的典型特征，与相关研究报道的结果相同[21-22]。

BADH 是甜菜碱合成过程中的两个关键酶之一，在植物抗逆过程中起重要作用，目前，已利用基因工程手段，将BADH 基因转入农作物，使农作物的抗性得到不同程度的提高。本试验为进行CmBADH 组织特异性表达、亚细胞定位、表达调控研究以及利用CmBADH 基因提高植物抗逆性，后期培育抗逆作物品种奠定基础。