绿色棉纤维发育过程中DNA表观遗传变化的甲基化敏感扩增多态性分析

钱森和，洪亮，魏明，林毅，蔡永萍

(1.安徽工程大学生化学院，安徽芜湖241000；2．安徽农业大学生命科学学院，合肥230036)

绿色棉纤维发育过程中DNA表观遗传变化的甲基化敏感扩增多态性分析

钱森和1,2，洪亮2，魏明1，林毅2，蔡永萍2

(1.安徽工程大学生化学院，安徽芜湖241000；2．安徽农业大学生命科学学院，合肥230036)

【目的】分析绿色棉纤维发育过程中DNA甲基化状态差异。【方法】利用2组限制性内切酶EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ对绿絮棉1号纤维基因组甲基化位点进行识别和切割，并采用甲基化敏感扩增多态性引物对切割产物进行扩增，分析基因组内5'-CCGG-3'位点的甲基化状态；同时对扩增的差异片段进行测序，分析其生物学功能。【结果】66对甲基化敏感扩增多态性引物共扩增出4112个条带；平均每个样品共扩增出822.4个带型，平均每对引物扩增出12.46个片段。随着绿色棉纤维的发育，甲基化条带总数、甲基化条带比率、全甲基化条带百分比均逐渐升高；其中，开花后10、15、20和25 d时甲基化条带总数分别比开花后5 d时增加11.45%，13.86%，20.10%和33.13%。与开花后5 d相比，开花后10、15、20和25 d时纤维DNA发生甲基化变化位点的比例分别为3.15%，3.43%，3.65%和2.52%；而去甲基化位点的比例分别为12.87%，14.72%，13.31%和48.81%。通过测序和Blast分析表明，17个片段与已知的功能基因同源性较高，包括棉花线粒体基因组、丝氨酸蛋白酶基因和酯酶基因，且这些基因均在开花后25 d发生去甲基化。【结论】绿色棉纤维发育过程中DNA发生了甲基化与去甲基化现象。

绿色棉；纤维发育；表观遗传；甲基化敏感扩增多态性分析

绿色棉是实行商业化应用的天然彩色棉两大色系中的1种，其纤维细胞分化突起与白色棉相同，但突起时间较迟，早期伸长较慢，且较早就停止伸长，从而造成了绿色棉纤维最终长度较短[1-2]。另外，绿色棉纤维素含量低于普通白色棉，但其积累规律同样呈不对称的S型增长曲线[3]。天然绿色棉纤维中纤维素积累的最大增长速率低，快速增长期的积累速率低、持续时间短不利于纤维素积累[4]。由此，绿色棉纤维生长发育规律已基本明确，然而有关绿色棉纤维发育的分子机制仍缺乏深入研究。

DNA甲基化是真核生物基因组中最常见的1种DNA共价修饰方式，根据EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/Msp这2组甲基敏感性限制性内切酶对基因组甲基化位点的识别和切割差异，可以对基因组范围内5'-CCGG-3'位点的甲基化程度及其状态进行分析[5]。DNA甲基化在植物基因表达、基因沉默、细胞分化、系统发育中起重要的调节作用[6-7]。在植物生长周期中，随着遗传和环境变化而发生的不同发育反应，主要取决于基因的不同转录表达，而DNA甲基化水平和模式的变化是基因转录表达调控的1种重要方式[8]。另外，在植物不同组织之间以及不同发育时期，DNA甲基化水平和模式存在一定的差异。例如，利用甲基化敏感扩增多态性（Methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP）技术研究发现，拟南芥子叶、叶片和花的DNA甲基化水平和模式均存在一定差异[9]；水稻幼苗与成长植株之间DNA甲基化情况也不尽相同[10]。绿色棉纤维同样是高度特化的植物细胞，其发育是多基因表达调控的复杂过程，并且会涉及特异蛋白的合成和特异基因的选择性表达[11]。然而，目前有关绿色棉纤维发育的分子机制报道较少。因此，本试验以绿色棉纤维为材料，采用MSAP技术研究绿色棉纤维发育过程中DNA甲基化水平和模式的变化规律；并通过特异表达片段的分离与鉴定，探索这些片段与已知功能基因的同源性，揭示绿色棉纤维发育的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

本试验材料为绿色棉品种绿絮棉1号，2013年种植于安徽农业大学农场（安徽省合肥市大杨镇），行距100 cm，株距50 cm，常规田间管理。在盛花期对当日开花棉铃进行挂牌，挂牌后第5天起，每隔5 d取样1次，直至第25天。每次取样后立即放入液氮罐中带回实验室，并转入到－70℃冰箱保存，用于MSAP分析。

主要试剂有dNTPs、RNA酶、Taq酶，均购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶MspⅠ、HpaⅡ、EcoRⅠ、PMD-T 载体试剂盒以及T4DNA连接酶，均购自Takara公司；引物序列见表1，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 棉花纤维基因组提取。采用改良后的CTAB法[12]，提取棉花纤维DNA。将提取后的DNA加入30 μL的ddH2O溶解，并加入10 mg·mL－1RNA酶进行纯化。提纯后的DNA，分别采用核酸浓度测定仪和1%（质量分数）琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和质量，之后保存于－70℃冰箱中以备用。

1.2.2 DNA酶切与连接。采用分步酶切法，即先用EcoRⅠ对纤维DNA模板进行酶切，再将酶切产物分别用HpaⅡ和MspⅠ酶切。①EcoRⅠ酶切反应体系：500ng的DNA模板，10U的EcoRⅠ(Thermo)，2 μL 的 10×bufferEcoRⅠ [500 mmol·L－1Tris-HCl（pH 7.5），1000 mmol·L－1NaCl，100 mmol·L－1MgCl2，0.2%（质量分数）Trition X-100，1 mg·mL－1BSA]，加 ddH2O 至 20 μL，反应混合液于37℃温浴12 h，之后于65℃水浴中变性20 min。 ②HpaⅡ和 MspⅠ酶切反应体系：20 μL 上述酶切产物，10 UHpaⅡ (或 MspⅠ)，3 μL 10×buffer Tango[330 mmol·L－1Tris-Ac（pH 7.9），100 mmol·L－1Mg-Ac，660 mmol·L－1K-Ac，1 mg·mL－1BSA]，加 ddH2O 至 30 μL，反应混合液于37℃温育 12 h，之后于 65℃（HpaⅡ）或 80℃（MspⅠ）水浴中变性20 min，备用。③反应体系（40 μL）：上述双酶切产物 30 μL，T4DNA 连接酶（Thermo）1 μL，EcoR Ⅰ -adapterⅠ 和 EcoR Ⅰ-adapterⅡ 接 头 引 物 各 1 μL，HpaⅡ /Msp Ⅰ-adapterⅠ和HpaⅡ/MspⅠ-adapterⅡ接头引物各1 μL，10 ×T4DNA Ligase buffer 4 μL，Nuclease-free water 1 μL； 反应液于22℃连接12 h，连接后的产物稀释10倍，备用。

表1 MSAP的接头和引物序列Table 1 Sequences of adaptors and primers for MSAP

1.2.3 聚合酶链式反应 （Polymerase chain reaction，PCR）。预扩增引物为E0和H0的组合。预扩增反应体系 25 μL， 包括 EasyTaq10×buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，EasyTaqfor PAGE 0.25 μL，E01.5 μL，H01.5 μL，Nuclease-free water 16.25 μL，连接产物1.0 μL。预扩增PCR反应程序为95℃30 s，56℃ 1 min，72℃1 min，共 20 个循环。

选择性扩增引物为E1―E11与H1―H6的组合，共成66对。选择性扩增体系为25 μL，包括EasyTaq10 ×buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，Easy Taqfor PAGE 0.25 μL，Hi0.5 μL，Ei0.5 μL，Nuclease-free water 18.95 μL，预扩增产物 0.3 μL。选择性扩增PCR反应分为2步，第1步为：95℃30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 20 个循环，每循环下降 0.7℃； 第 2步为：95℃ 30 s，56℃30 s，72℃1 min，共23个循环。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染。对1×TBE电泳缓冲液预电泳20 min后，将选择性PCR扩增产物和Loading buffer缓冲液 [0.25%（质量分数）溴酚蓝，0.25%（质量分数）二甲苯青，用10 mL去离子甲酰胺溶解]按5∶1的体积比混合，每个样品取4.0 μL上样，100 W恒定功率电泳1.5 h。硝酸银染色后拍照，并进行H（EcoRⅠ/HpaⅡ）和M（EcoRⅠ/MspⅠ）泳道条带数及带型统计分析。每条带代表1个酶切识别位点，条带的有无分别采用1和0表示。

中医整体护理以中医学理论为基础,病位在晶珠,主要因气血不足、年老体衰、情志不畅引起[2]。根据“七情养生”的方式对患者进行情志护理,使患者心情舒畅,以情胜情、调畅情志,缓解患者焦虑、悲观心里理,避免优思伤肝,保护晶珠。环境护理为患者提供舒适的就诊环境,提高患者的舒适度,引导患者规律作息,减少不良刺激。劳逸结合能够改善患者血液循环,使患者身心放松,气血充沛,营养晶珠[3]。中医有“医食同源”的说法,对患者进食饮食护理不仅能提高患者的营养状况,还能提高晶珠透明度,改善患者视力。穴位按摩可以明目安神、宁神精心,保护眼睛。

1.2.5 MSAP差异片段的回收、测序和功能分析。切下差异条带后，放入0.5 mL的PCR管中，加入20 μL ddH2O，并于沸水浴中煮15 min，以溶解于水中DNA作为模板进行二次PCR扩增。扩增产物加 10 μL 6×Loading buffer，然后采用 1%（质量分数）的琼脂糖电泳分离条带，并在紫外灯下割胶回收，胶回收采用上海生工胶回收试剂盒；胶回收的产物连接入T-Vector后转化入E.coliDH5α，经蓝白斑筛选后，挑取阳性克隆，于37℃振荡培养4 h，菌液浑浊后送上海生工有限公司进行测序。对获得的序列，在NCBI（National center for biotechnology information）数据库中利用BLASTX和BLASTN在线程序进行同源性分析，推测其可能的功能。

表2 不同发育时期绿色棉纤维总DNA提取质量的紫外检测结果Table 2 The result of ultra-violet analysis on fiber DNA of green cotton during different development stages

图1 绿色棉纤维总DNA的凝胶电泳结果Fig.1 Gel electrophoresis of DNA isolated from fiber for green cotton

图2 绿色棉纤维MSAP聚丙烯酰胺分析胶带型及其DNA甲基化模式Fig.2 The result of MSAP and DNA methylation patterns for fiber of green cotton

2 结果与分析

2.1 绿色棉纤维总DNA样品的电泳检测

由表2可知，提取的各时期纤维总DNA纯度较高，OD260/OD280值均在1.8左右。从其DNA电泳结果（图1）可以看出，各样品均得到了较完好的总DNA，未发现降解现象；另外，DNA的电泳条带锐利，且蛋白质和RNA残留较少，说明总DNA的纯度较高。

2.2 不同时期棉纤维DNA甲基化水平变化

同裂酶HpaⅡ和MspⅠ均能够识别DNA序列中的5'-CCGG-3'位点，然而对DNA序列内该位点甲基化的敏感性不同。样品DNA经过EcoRⅠ/Msp和EcoRⅠ/HpaⅡ酶切后的产物会有4种结果，但在PAGE胶上往往只能显示出3种（图2），其中，第1类（TypeⅠ）代表5'-CCGG-3'位点没有发生甲基化，即均有带；第2类（TypeⅡ）代表5'-CCGG-3'位点发生半甲基化，即前者有带而后者没有带；第3类（TypeⅢ）代表5'-CCGG-3'位点发生全甲基化，即前者无带而后者有带。

采用66对MSAP选择性扩增引物对不同时期绿色棉纤维DNA样品进行MSAP的PCR扩增分析结果见表3。从中可以看出，开花后10 d MSAP扩增的总带数较多，开花后15 d、20 d和25 d次之，且条带数相近，而开花后5 d的条带数最少。对甲基化条带总数分析可知，从开花后5 d到25 d，甲基化条带总数逐渐增多，开花后10 d、15d、20 d和 25 d比开花后 5 d时分别增加11.45%，13.86%，24.10%和33.13%。

在绿色棉纤维发育的上述5个时期中，未发生甲基化（TypeⅠ型）带数最多，全甲基化（TypeⅢ型）带数次之，半甲基化（TypeⅡ型）带数最少；且开花后10 d、15 d、20 d和25 d的半甲基化带数比开花后 5 d分别增加 11.86%，16.95%，25.42%和30.51%；其全甲基化条带比开花后5 d分别增加11.2%，12.14%，23.36%和34.58%。另外，随着绿色棉纤维发育进程的推进，绿色棉纤维甲基化条带比例、全甲基化条带百分比均逐渐增加，说明纤维发育的过程（开花后5～25 d）中，DNA发生甲基化的位点数逐渐增多。

表3 绿色棉纤维发育过程DNA甲基化水平的变化Table 3 Changes of DNA methylation levels and patterns during different development stages for green cotton

与开花后5 d相比，其他时期绿色棉纤维DNA甲基化敏感性扩增共呈现出11种带型 （表4和图3），这11种带型分为2大类：单态性和多态性。单态性是指与开花后5 d相比，其他时期（开花后10～25 d）的带型无变化，即纤维发育整个时期都具有相同的带型（A型），说明绿色棉纤维发育整个时期基因组DNA的5'-CCGG-3'位点的甲基化状态没发生变化；其中，A型又分为3类，A1型为无甲基化，A2为半甲基化，A3为全甲基化。多态性是指与开花后5 d相比，其他时期基因组DNA甲基化状态发生了改变，说明在开花后 10～25 d，绿色棉纤维基因组DNA的5'-CCGG-3'位点的甲基化状态与开花后5 d相比发生了变化，这种多态性又分为2类，即甲基化（B型）和去甲基化（C型）。其中，B型中的B1和B2是重新甲基化 （开花后5 d时M和H泳道都有条带，而其他时期只有M或H泳道有条带），B3和B4是超甲基化（开花后5 d时只有H或M有条带，而其他时期H和M均无条带），B型说明与开花后5 d相比，其他时期纤维基因组DNA发生甲基化水平升高变化；C型包括C1、C2、C3和C4，是去甲基化类型，C型甲基化状态与B型相反，说明与开花后5 d相比，其他时期纤维基因组DNA发生了甲基化水平降低的变化。开花后5 d与其他时期的甲基化模式A、B和C以及相应的位点数见表4。

由表4可以看出，与开花后5 d相比，开花后10 d、15 d、20 d和25 d时的DNA甲基化程度未发生改变的类型（A型）分别占83.98%，81.84%，83.04%和48.67%，DNA甲基化程度升高的类型（B型）分别占3.15%，3.43%，3.65%和2.52%，甲基化程度降低类型 （C型）分别占12.87%，14.72%，13.31%和48.81%。由此可见，随着绿色棉纤维的发育，其多态性逐渐增多。

2.4 MSAP差异片段的序列分析

通过MSAP分析，对绿色棉纤维DNA的多态性甲基化变异位点进行了回收、克隆，得到了29条甲基化位点发生变异的DNA片段序列，但经BLAST比对后表明，17条甲基化修饰序列检索到了同源序列。这些同源序列的甲基化模式在纤维不同发育时期发生不同变化，具体见表5。

通过在Genebank网站数据库上的Blast比对分析发现，这17个片段中与已知棉花相关序列同源性较高的序列有11条。其中：Seq4、Seq5、Seq10、Seq12和Seq17同源于棉花线粒体基因组，且在开花后25 d时发生去甲基化；Seq6同源于棉花扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）标记的基因组序列克隆 B；Seq8、Seq9、Seq11 和 Seq13 同源于陆地棉NBRI_GE13671微卫星序列的克隆；Seq14同源于陆地棉克隆ML-2甲基化敏感的多态位点的基因组序列。另外，还发现蛋白水解酶类基因序列（Seq3）、分离酶基因序列（Seq15）、酯酶基因序列（Seq16），且在开花后25 d去甲基化。

表4 DNA甲基化状态变化Table 4 DNA methylation pattern of green cotton fiber

3 讨论

DNA甲基化现象广泛存在于多种生物体中，植物中有20%～30%的基因组DNA胞嘧啶处于甲基化状态[13]。DNA甲基化是植物正常生长和发育所必需的，甲基化水平过高或不足，均会导致植物表型和发育的异常[14]。棉花生长发育过程中也存在DNA甲基化现象，郭宁等[15]通过乙烯利处理棉花子叶，并对其基因组进行MSAP扩增，每个样品平均扩增出855个带型，平均每对引物扩增出12.95个片段。本研究中，采用66对MSAP引物对绿色棉纤维发育过程中DNA进行PCR扩增，共扩增出4112个条带；每个样品平均扩增出822.4个带型，平均每对引物扩增出12.46个片段，这与郭宁等[15]结果相近；说明DNA甲基化同样发生于绿色棉纤维发育过程中。

图3 绿色棉纤维MSAP扩增结果Fig.3 The result of MSAP for green cotton

植物DNA甲基化不仅具有组织特异性，而且还具有时空性[16]。同一组织的不同发育阶段，基因组DNA甲基化水平和模式有所不同；在番茄果实成熟过程中，CG甲基化水平逐渐降低[17]；而毛竹基因组DNA甲基化水平随生理年龄的增加呈上升趋势[18]。另外，植物DNA甲基化水平和模

式受到外界胁迫的影响，乙烯利处理后棉花子叶的甲基化水平和甲基化模式以及甲基化多态性均发生了改变[15]。本研究发现，随着绿色棉纤维的发育，其DNA发生甲基化的位点数逐渐增多，其甲基化条带总数、甲基化条带比例、全甲基化条带百分比均随着绿色棉纤维生育进程 （开花后5～25 d）逐渐升高，这与李廷春[19]对棕色棉纤维发育过程中甲基化水平和模式的变化趋势相一致。绿色棉的纤维发育阶段与白色棉相同，但绿色棉在纤维发育过程中伴随着纤维素合成的同时，纤维色素也在不断合成[3]；Qian等[20]研究表明，绿色棉纤维发育过程中，纤维发育基因和色素合成基因表达均发生了明显的变化。不过，DNA甲基化是否参与了这一系列基因表达调控，还需要进一步证实。另外，绿色棉纤维的发育过程是一个纤维逐渐脱水成熟过程，在此过程中，纤维处于脱水逆境中，而DNA甲基化位点和比例增多可能参与了纤维对脱水逆境的响应。

表5 绿色棉DNA 甲基化多态性序列BLAST 比对结果Table 5 BLAST result of the DNA methylation polymorphic sequences for green cotton

表5 （续）Table 5 （Continued）

DNA甲基化水平和模式的变化与基因沉默、基因表达等调控密切相关；常染色质中启动子区高度甲基化往往会导致基因沉默，而活跃的基因表达常与DNA去甲基化相关联[21-22]。研究表明，CG和非CG甲基化都缺失的植株当代均不能生存，其发育过程中出现胚细胞分裂和极性的异常，从而导致死亡[22]。破坏胞嘧啶甲基化的拟南芥植株虽然能够维持生长，但形态却发生明显的变异[23]。本研究表明，绿色棉纤维发育过程中DNA发生甲基化以及去甲基化现象，可能是其基因表达调控方式之一。

郭宁等采用MSAP技术筛选出了部分与乙烯胁迫诱导相关的基因片段，如果胶甲酯酶基因、乙醇脱氢酶基因A、膜结合转录因子肽酶等，这些基因可能与乙烯利诱导棉花子叶的衰老过程有关[15]。本研究筛选出了棉花线粒体基因组基因、丝氨酸蛋白酶基因、酯酶基因等序列。其中，线粒体通过生物氧化为细胞提供能量，也是真核细胞内自由基生成及调控细胞凋亡的关键细胞器[25]；丝氨酸蛋白酶是最大的1类蛋白酶家族，广泛参与植物的衰老、细胞分化、程序化细胞死亡、蛋白质降解与加工等生理过程[26]；酯酶不仅影响生物的物质及能量代谢，还参与基因表达调控、酶活性调节、细胞信号转导和植物抗逆性调控[27]。分离到的这些基因均在开花后25 d去甲基化，可能与绿色棉纤维色素合成的能量代谢、纤维细胞的凋亡、纤维的成熟衰老等过程有关，但其具体作用还有待于证实。另外，本研究在对甲基化多态性片段的分离、克隆与鉴定中尚未找到与绿色棉纤维色素合成相关的直接证据；其中，分离到的已知功能的基因同源片段与纤维色素合成的相关性较小，而未知功能的基因同源片段与纤维色素合成是否相关仍有待于进一步研究。

4 结论

利用MSAP技术分析了绿色棉纤维发育过程中DNA甲基化的变化情况。结果表明，随着绿色棉纤维的发育，甲基化条带总数、甲基化条带比率、全甲基化条带百分比均逐渐升高。分离得到了棉花线粒体基因组、丝氨酸蛋白酶和酯酶等相关基因，这些基因均在开花后25 d时发生去甲基化。

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Methylation-sensitive Amplified Polymorphism Analysis of Epigenetic Changes during Fiber Development in Green Cotton(Gossypium hirsutumL.)

Qian Senhe1,Hong Liang2,Wei Ming1,Lin Yi2,Cai Yongping2
(1.Department of Biochemistry,Anhui Polytechnic University,Wuhu,Anhui241000,China;2.Life Science School,Anhui A-gricultural University,Hefei230036,China)

[Objective]The aim of this study was to analyze the DNA methylation during fiber development in green cotton.[Method]The products resulting fromEcoRI/HpaII andEcoRI/MspI double-digestions were amplified by methylation-sensitive amplified polymorphism primers to analyze the methylation status of the 5'-CCGG-3'locus in the'Lüxumian No.1'genome.Meanwhile,the amplified fragments were sequenced to characterize their biological functions.[Result]A total of 4 112 fragments were amplified by 66 primer pairs,with an average of 822.4 fragments each.Additionally,each primer amplified an average of 12.46 fragments.The number of methylated fragments at 10,15,20,and 25 days post anthesis(DPA)was 11.45%,13.86%,20.10%,and 33.13%higher than the number of methylated fragments at 5 DPA,respectively.At 10,15,20,and 25 DPA,3.15%,3.43%,3.65%,and 2.52%of the green cotton fiber genomic loci were methylated,respectively.In contrast,at the same time points,12.87%,14.72%,13.31%,and 48.81%of the loci were demethylated,respectively.The sequencing results and BLAST searches revealed that 17 gene fragments were homologous to known functional genes,including those from the cotton mitochondrial genome as well as the genes encoding a serine protease and an esterase.These genes were methylated at 25 DPA.[Conclusion]Genes are methylated and demethylated during green cotton fiber development.

green cotton;fiber development;epigenetic;methylation-sensitive amplified polymorphism analysis

S562.03

A

1002-7807(2017)04-0316-11

10.11963/1002-7807.qshqsh.20170405

2016-07-15

钱森和（1978―），男，博士，qiansenhe@163.com

安徽省棉花产业技术体系；安徽省高校自然科学基金(KJ2014A078)