岗稔根正丁醇提取物对CCl4诱导小鼠肝纤维化中ERK/MAPK通路的影响*

毕研蒙, 胡正进, 王 荣, 刘 媛△

1山东省济宁医学院中西医结合学院,济宁 272067 2昆明市中医医院脾胃肝病科,昆明 650051

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是机体对各种慢性炎症所致肝损伤的一种修复反应,也是发展到肝硬化、甚至原发性肝癌经历的共同病理生理学过程[1]。肝纤维化致病因素众多,形成机制复杂。目前来说临床上并没有公认的抗肝纤维化特效药物。因此,对肝纤维化的防治研究进行深入探讨具有重要意义。

岗稔作为岭南中药的一种,其功效包括理气止痛、利湿止泻、散瘀止血。其药用价值在《本草纲目》、《本草纲目拾遗》等本草专著中已有详细记载[2-3]。过去几十年来人们对于天然药物的开发投入了大量的时间和精力,对于有潜力进行疾病预防及治疗的新天然产物的发现和评估进行了大量的工作,现代研究表明[4]岗稔中主要含有酚类、单宁类、花青素、黄酮类及挥发油等,具有抗氧化、抗菌、抗病毒、降糖等药理活性和应用价值。临床上,不乏以岗稔为主的中药用于治疗肝病[5-6]。综上,岗稔具有改善肝纤维化的潜能,目前国内外关于岗稔化学成分的研究主要集中在叶、果实、茎、种子部位,但是岗稔根中的活性成分尚未可知。

本研究拟以肝星状细胞及四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型为研究载体,筛选岗稔根不同提取物抗肝纤维化的活性,并探讨其改善肝纤维化的机制,为开发抗纤维化药物奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物和细胞

C57BL/6小鼠,雄性,6～8周龄,购于广州中医药大学实验动物中心,实验动物许可证号:44005800005787。细胞系:人肝星状细胞系HSC来源于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇均为分析纯,购于广州化学试剂厂,氯仿购于天津市津东天正精细化学试剂厂。高糖DMEM培养液(美国Gibco公司),胎牛血清(美国Gibco公司),CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒(日本同仁),二甲基亚砜DMSO(美国Sigma公司),0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司),青-链霉素溶液(北京索莱宝公司)。α-SMA(Rabbit,1∶1000),GAPDH(Rabbit,1∶1000),STAT3(Rabbit,1∶1000)、Akt(Rabbit,1∶1000)、ERK1/2即P44/42(Rabbit,1∶1000)、P38(Rabbit,1∶1000)、p-STAT3(Rabbit,1∶1000)、p-Akt(Rabbit,1∶1000)、p-ERK1/2即p-P44/42(Rabbit,1∶1000)和p-P38(Rabbit,1∶1000)购于Cell Signaling Technology,四氯化碳分析纯液(美国Sigma公司,货号1601168)、PDGF ELISA试剂盒(货号CSB-EL017709MO),购于武汉华美生物工程有限公司。超氧化物歧化酶(SOD,货号A001-3)、丙二醛(MDA,货号A003-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px,货号A006-2)及羟脯胺酸(HYP,货号A030-2)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2.2 仪器 旋转蒸发仪(N-1000V-W EYELA);循环水真空泵(A-1000S EYELA);细胞培养瓶及细胞培养板(美国Corning公司);多功能酶标仪(美国BioRad公司);倒置显微镜(日本Olympus日本,Bx60)。

1.3 方法

1.3.1 岗稔根不同萃取部分的制备 岗稔根生药材10 kg,加8倍水,两次加热回流提取,每次回流提取4 h,将提取液趁热过滤,合并两次滤液后在旋转蒸发仪中浓缩制备岗稔根浸膏860 g。然后取岗稔水提干浸膏560 g加入约2 L蒸馏水充分溶解,倒入分液漏斗,用1.5 L石油醚萃取,留取石油醚层;重复上述萃取步骤4～5次,合并石油醚层;剩余混合物依此用乙酸乙酯和水饱和正丁醇重复萃取4～5次。萃取后所得到的为石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物,余下为水提取物。分别倒入圆底烧瓶,用旋转蒸发仪蒸干,并用电子秤称量所得药物的质量。

1.3.2 制备供试品 精确称取岗稔根石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物各20 mg,用培养液将每个部位提取物的供试品倍比稀释。

1.3.3 细胞分组给药 细胞贴壁后,加入PDGF 10 ng/mL预处理2 h保证肝星状细胞处于活化状态,每孔分别加入4种药物供试品溶液100 μL,每种药物,每个浓度,设6个复孔,未加药的孔为对照组,加PBS的孔为调零孔。加药完成后将96孔培养板继续放入37℃的CO2培养箱中培养48 h。

1.3.4 CCK-8检测 96孔培养板培养48 h后取出,弃去上清,每孔加入CCK-8工作液(10 μL CCK-8原液+90 μL培养液),继续放入37℃的CO2培养箱中培养1.5 h,放入酶标仪中,在450 nm处测定吸光度(A)值,计算细胞存活率。细胞存活率=(给药实验组平均A值-调零孔平均A值)/(细胞对照组平均A值-调零孔平均A值)×100%。

1.3.5 动物造模、分组及给药 将50只小鼠分为5组,对照组10只,模型组10只,N-RHT高、低剂量组(1 g/kg和0.5 g/kg)各10只,秋水仙碱组10只。对照组小鼠予以1.5 mL/(kg·d)纯橄榄油腹腔注射;余下各组每只小鼠均按四氯化碳橄榄油溶液(25%,CCl4∶橄榄油=1∶3)2 mL/(kg·d)腹腔注射,频率3次/周,持续时间5周。造模第1周起给予所有药物干预组小鼠药物灌胃。N-RHT低剂量组:CCl4橄榄油溶液腹腔注射30 min后,0.5 g/kg N-RHT药物悬浊液灌胃;N-RHT高剂量组:CCl4橄榄油溶液腹腔注射30 min后,给予N-RHT高剂量(1 g/kg)悬浊液灌胃。秋水仙碱组:CCl4橄榄油溶液腹腔注射30 min后,给予0.2 mg/kg秋水仙碱悬浊液灌胃。实验期间,按昼夜时程,给予所有组别小鼠正常营养颗粒饲料及饮用水。

1.3.6 标本采集及称重 各实验组造模完成后,200 mg/kg戊巴比妥麻醉小鼠,心脏采血后解剖小鼠,将肝脏和脾脏完整取出,吸干血液,剪去表面的脂肪和系膜后进行称重,脏器指数=器官质量(g)/动物体质量(g)×100%。

1.3.7 检测小鼠血清ALT和AST水平 心脏采血后全血静置于4℃冷藏,隔夜后3000 r/min离心10 min,分离出血清,放于-80℃超低温冰箱用于ALT和AST检测。

1.3.8 血清生化指标检测 严格按相应试剂盒说明书进行血生化指标检测,采用ELISA法检测血清中PDGF、HYP和GSH-Px的含量,TBA法和WST-1法检测MDA和SOD的活性。

1.3.9 肝组织病理学检查 ①苏木精-伊红(HE)染色:4%PFA固定好的肝脏组织常规脱水,石蜡包埋,切片,脱蜡(60℃烤片3 h)至水,苏木精染色10 min,流水冲洗8 min,1%盐酸乙醇分化1 s,流水冲洗8 min,伊红染液2 min 30 s,脱水,透明,中性树胶封片,通风处晾干,显微镜下观察形态并拍照。②Masson染色:苏木精液染核7 min,流水冲洗8 min,1%盐酸乙醇分化1 s,蒸馏水洗8 min,Masson丽春红酸性复红液7 min,2%冰醋酸浸泡5 s,1%磷钼酸水溶液3 min,苯胺蓝染色5 min,浸泡在0.2%冰醋酸5 s,二甲苯透明,中性树胶封固。③天狼星红(Sirius red)染色:石蜡切片水化,天青石蓝液10 min,蒸馏水洗10 min,冲洗3次,天狼星红饱和苦味酸液15～30 min,脱水分化。

1.3.10 免疫印迹法 Western blot检测肝脏组织中α-SMA蛋白质的表达,蛋白提取严格遵循冰上操作原则,取出保存于-80℃冰箱的肝组织,加入0.1 mL RIPA裂解液进行冰上超声裂解,于4℃以12000 r/min离心15 min,取上清液分装于EP管中,存储至-80℃冰箱备用。

1.3.11 免疫组织化学染色 切片脱蜡至水同HE染色法,微波炉加热进行抗原修复,一抗4℃封闭过夜(α-SMA 1∶500),二抗室温孵育1.5 h,PBS冲洗后进行DAB染色,中性树脂封片。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 岗稔根4个极性部位提取物的活性筛选

运用CCK-8法检测岗稔根4个极性部位提取物对肝星状细胞增殖的影响,结果提示岗稔根石油醚部位(P-RHT)、乙酸乙酯部位(E-RHT)和正丁醇部位(N-RHT)、水部位(W-RHT)4个部位的IC50值分别为458.2 μg/mL、68.34 μg/mL、61.27 μg/mL、3747 μg/mL;然后运用Western blot检测岗稔根4个极性部位提取物对肝星状细胞中α-SMA蛋白质的影响。结果提示,在岗稔根4个极性部位提取物中,只有N-RHT浓度的梯度升高,伴随着α-SMA蛋白的表达逐渐下降,且差异具有统计学意义(F=1123,P<0.01),如图1～4所示。

图1 P-RHT对活化的肝星状细胞中α-SMA蛋白的影响Fig.1 Effect of P-RHT on α-SMA protein in activated hepatic stellate cells

与0 μg/mL组比较,**P<0.01图2 E-RHT对活化的肝星状细胞中α-SMA蛋白的影响Fig.2 Effect of E-RHT on α-SMA protein in activated hepatic stellate cells

与0 μg/mL组比较,**P<0.01图3 N-RHT对活化的肝星状细胞中α-SMA蛋白的影响Fig.3 Effect of N-RHT on α-SMA protein in activated hepatic stellate cells

图4 W-RHT对活化的肝星状细胞中α-SMA蛋白的影响Fig.4 Effect of W-RHT on α-SMA protein in activated hepatic stellate cells

2.2 N-RHT对四氯化碳诱导的小鼠体重的影响

如表1所示,记录了实验周期中各组小鼠的体重变化情况。不同组别体重具有统计学差异(F=41.433,P<0.01)。与对照组小鼠相比,模型组小鼠腹腔注射四氯化碳1周后体重较前下降(P<0.05),然后缓慢增长,但增长速度较对照组有所降低;腹腔注射四氯化碳5周后,模型组小鼠体重显著低于对照组(P<0.01)。秋水仙碱组、N-RHT低、高剂量组与模型组小鼠相比,体重显著增加(均P<0.01)。

表1 各组小鼠体重的变化情况比较Table 1 Comparison of changes in body weight of mice in each

2.3 N-RHT对四氯化碳诱导的小鼠肝脾指数的影响

从小鼠肝脾指数来看,与对照组比较,模型组小鼠肝脾指数明显增大(均P<0.05);N-RHT高剂量和低剂量组小鼠肝脾指数较模型组明显降低(均P<0.05),如表2所示。

表2 N-RHT对小鼠脏器指数的影响Table 2 Effect of N-RHT on the organ indices

2.4 N-RHT对四氯化碳诱导的小鼠肝功能的影响

ALT和AST作为临床上评价肝功能损伤的传统生化指标,当肝脏损伤达到一定程度后,血清ALT和AST会升高。如表3所示,模型组血清ALT和AST较对照组明显增高(均P<0.01);N-RHT低、高剂量组的ALT和AST显著低于模型组,差异有统计学意义(均P<0.01);秋水仙碱组的血清ALT、AST含量与模型组及对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05),提示N-RHT具有保护肝细胞,减轻肝损伤作用。

表3 N-RHT对小鼠血清中ALT和AST的影响Table 3 Effect of N-RHT on serum ALT and

2.5 N-RHT对四氯化碳所诱导的肝纤维化小鼠血清中HYP、血小板衍生生长因子(PDGF)含量的影响

HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标,PDGF是肝纤维化发展过程中重要的细胞因子。如表4所示,模型组小鼠的血清中HYP含量和PDGF含量明显升高,与对照组、N-RHT低、高剂量组以及秋水仙碱组相比差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。N-RHT低、高剂量处理可明显降低模型组小鼠血清HYP和PDGF含量,提示N-RHT具有减少胶原沉积,延缓肝纤维化发展的作用。

2.6 N-RHT对小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)活性的影响

SOD、GSH-Px和MDA可以反映肝脏的氧化应激损伤程度。如表4所示,与对照组相比,模型组小鼠血清中SOD、GSH-Px活性显著降低(均P<0.01),而MDA含量显著提高(P<0.01);秋水仙碱组、N-RHT低、高剂量组血清中SOD、GSH-Px较模型组升高,MDA较模型组降低,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。提示肝纤维化模型小鼠的抗氧化水平显著降低,氧化损伤明显,N-RHT能提高肝纤维化模型小鼠肝脏的抗氧化能力,减少肝脏的氧化应激损伤。

表4 各组小鼠血清中HYP、PDGF、GSH-Px、MDA以及SOD含量的比较Table 4 Comparison of serum HYP,PDGF,GSH-Px,MDA and SOD levels in each

2.7 小鼠肝组织病理学检查结果

2.7.1 小鼠肝组织HE染色 HE染色显示,对照组小鼠肝小叶结构完整,肝细胞呈放射状排列,汇管区清楚,无胆管增生及纤维组织增生;模型组小鼠肝细胞空泡样变,有明显灶状坏死,肝细胞排列不规整,可见大量炎性细胞浸润,小胆管伴纤维组织增生。与模型组相比,秋水仙碱组肝小叶结构较清晰,门脉区有少量炎性细胞分布,肝细胞空泡样变明显减少。N-RHT低剂量组肝细胞排列较规整,肝细胞空泡样变性减少。N-RHT高剂量组与模型组相比,肝细胞排列较紧密,肝细胞的肿胀程度,炎性细胞浸润程度均明显减轻,空泡样变性明显减少,未见明显的胆管及纤维组织增生。如图5所示。

图5 各组小鼠肝组织HE染色(×200)Fig.5 HE staining of liver tissues of mice in each group(×200)

2.7.2 小鼠肝组织Masson染色 Masson染色显示,对照组的小鼠肝组织未见炎细胞的浸润,没有空泡样变,肝细胞呈条索状分布,肝小叶的构造清晰而完整,没有不规则血窦,汇管区无扩大。模型组的小鼠Masson染色蓝色胶原纤维延伸而相互衔接,主要分布在血管壁、血管周围及细胞间质,包裹着整个肝小叶,而使正常肝小叶的结构破坏,导致假小叶形成。秋水仙碱组的肝纤维化程度较模型组减轻,可见少量的蓝色染色区域,纤维间隔形成较少,无明显假小叶形成。N-RHT低剂量组较模型组明显减轻,少许蓝色胶原纤维散在分布在血管周围;N-RHT高剂量组微量蓝色胶原纤维分布在血管周围,如图6所示,提示N-RHT有较好的减少胶原沉积的作用。

图6 各组小鼠肝组织Masson染色结果(×200)Fig.6 Masson staining of liver tissues of mice in each group(×200)

2.7.3 小鼠肝组织天狼星红染色 天狼星红染色显示,模型组红色胶原纤维明显,连续密集地分布在汇管区,N-RHT低剂量组和秋水仙碱组小鼠肝脏胶原红色胶原纤维形成较模型组减少,N-RHT高剂量组小鼠肝脏胶原纤维较模型组明显减少,可见微量胶原纤维分布在汇管区,如图7所示。此结果与Masson染色结果具有一致性,进一步验证了N-RHT有较好的减少胶原沉积的作用。

图7 各组小鼠肝组织天狼星红染色结果(×200)Fig.7 Sirus red staining of liver tissues of mice in each group(×200)

2.8 N-RHT对肝组织α-SMA蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示,相对于对照组来说,模型组α-SMA蛋白表达水平明显增高(P<0.01),而N-RHT不同剂量组α-SMA表达相对模型组明显减少(均P<0.01),如图8所示。免疫组化染色显示,对照组小鼠肝组织中α-SMA染色极淡且极稀少,相对于模型组连续而密集的黄色纤维集中于汇管区,秋水仙碱组和N-RHT高、低剂量组阳性染色区域明显减少,尤其是高剂量组更加明显,如图9所示。

与对照组比较,*P<0.05 **P<0.01;与模型组比较,△P<0.05 △△P<0.01图8 Western blot检测各组小鼠肝脏α-SMA蛋白表达差异Fig.8 Difference in α-SMA expression in liver tissues of mice in each group detected by Western blotting

与对照组比较,*P<0.05 **P<0.01;与模型组比较,△P<0.05 △△P<0.01图9 免疫组化法检测各组小鼠肝脏α-SMA表达差异(×100)Fig.9 Difference in α-SMA expression in liver tissues of mice in each group detected by immunohistochemical method (×100)

2.9 N-RHT对ERK/MAPK信号通路相关蛋白的影响

如图10所示,随着N-RHT浓度的升高,p-P44/42和P44/42的比值随着浓度的增加明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。p-P38/P38、p-STAT3/STAT3以及p-AKT/AKT的比值差异没有统计学意义。

A:Western blot结果显示N-RHT对HSC中P38、p-P38、P44/42和p-P44/42蛋白的影响;B:Western blot结果显示N-RHT对HSC中STAT3、p-STAT3、Akt和p-Akt的影响;C～F:蛋白水平定量分析;与对照组比较,**P<0.01;与5 μg/mL组比较,△△P<0.01图10 N-RHT在细胞模型上对肝纤维化相关信号通路的影响Fig.10 Effects of N-RHT on hepatic fibrosis related signaling pathways in cell models

3 讨论

肝纤维化是目前已知的各种慢性肝病最重要的病理特征,也是向肝硬化发展过程中的主要环节。HSC的激活为肝纤维化形成的核心环节[7]。肝星状细胞增殖能力可作为肝星状细胞的一种活化形式,因为星状细胞的活化受到抑制必然会导致增殖力的下降。肝受损时HSC被激活,在PDGF、TGF-β等生长因子激活下,细胞外基质形成增多,一旦超过纤维的降解即可导致肝脏纤维化[8-9]。中医药在“治未病”领域源远流长,对肝纤维化的预防和逆转具有独到的见解。中药可发挥多层次、多环节的综合调节作用[10]。因此本研究选用药食同源且对于临床肝病常用的中药——岗稔根活性部位进行筛选及分子机制的研究。

本研究首先采用CCK-8法对岗稔根四大部位提取物进行细胞水平的活性筛选,同时进行Western blot检测肝星状细胞中α-SMA蛋白的表达,发现N-RHT可抑制活化的肝星状细胞的增殖,显著降低α-SMA蛋白的表达。动物实验中,Western blot检测及免疫组化检测结果表明,α-SMA在模型组肝组织内阳性表达量显著增多,N-RHT干预后则使其表达量显著下降;体内外实验同时说明N-RHT可以抑制HSC的激活,具有较好的抗肝纤维化的活性。

动物实验研究结果表明N-RHT可以改善四氯化碳腹腔注射引起的小鼠体重减轻及肝脾肿大,血清学检查发现N-RHT可以降低小鼠血清中AST、ALT、PDGF和MDA的含量,升高SOD、GSH-Px的含量,提示N-RHT具有减轻肝细胞损伤、保肝降酶和抗氧化的作用。

病理检测是判断肝纤维化的金标准,病理学检查表明模型组的小鼠肝脏具有明显的纤维化病理改变,N-RHT低、高剂量组中肝细胞变性、炎症浸润及坏死等病变显著减轻,肝脏胶原纤维的沉积减少;结合血清中HYP含量降低,提示N-RHT可降低胶原蛋白沉积,促进胶原降解进而抑制胶原纤维的形成,延缓肝纤维化的进展。

有研究显示,PI3K/Akt/mTOR轴与HSC的生长和激活密切相关,从而促进肝纤维化的发生发展[11],因此在肝纤维化的发展过程中PI3K/Akt通路是肝纤维化的治疗靶点之一[12]。STAT3信号在炎症性疾病中起重要作用并且可以被PDGF激活[13],研究表明STAT3在肝病发病机制中起关键作用[14]。因此我们在细胞模型上检测Akt、p-Akt以及STAT3和p-STAT3蛋白的表达,发现p-Akt/Akt以及p-STAT3/STAT3的比值差异没有统计学意义,提示PI3K/Akt和STAT3信号通路可能不是N-RHT调控发挥抗肝纤维化的信号通路。

MAPK是一类丝/苏氨酸蛋白激酶家族,包括细胞外信号调节激酶ERK、应激活化蛋白激酶P38和c-Jun氨基末端激酶JNK[15]。其中ERK、P38作为关键激酶,调节细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞生物学效应[16]。P38通过炎症反应和细胞凋亡影响肝纤维化的进程[17-18];ERK信号通路参与Ⅰ型胶原分泌及肝星状细胞的增殖[19-20]。本次研究中我们检测了ERK相关蛋白P44/42及其磷酸化蛋白的表达,随着N-RHT浓度的增高,p-P44/42和P44/42的比值显著下调,提示ERK/MAPK信号通路可能参与了N-RHT抗肝纤维化的作用机制。

综上,N-RHT可抑制肝星状细胞的活化,抑制胶原蛋白沉积,具有保肝抗氧化的作用,其机制可能与抑制ERK/MAPK信号通路激活有关。本研究丰富了N-RHT治疗肝纤维化的理论依据,为N-RHT治疗肝纤维化的临床应用奠定了实验基础。