糖尿病肾病中足细胞损伤机制的研究进展*

康文武, 唐 倩, 严江天, 苏振宏, 梁凤霞△

1湖北中医药大学针灸骨伤学院,武汉 430061 2肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室,黄石 435003

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是一项全球性的公共卫生挑战,DN通常由2型糖尿病发展而来,是慢性肾病和终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的重要病因[1]。DN典型表现为持续的高蛋白尿和肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)下降[2]。糖尿病时高血糖、血流动力改变等因素持续损害着肾小球滤过屏障(glomerular filtration barrier,GFB),而GFB的改变直接导致了蛋白尿的发生发展。高蛋白尿是肾小球病变的标志,足细胞又是GFB的关键组成部分,所以足细胞损伤是DN发展的核心机制[3]。因此,本文阐述了DN中足细胞损伤模式并分析其多种损伤机制,旨在为后续的研究提供思路和方向。

1 足细胞及其在DN中的损伤模式

足细胞是一种终末分化的、高度特化的肾小球脏层上皮细胞,它附着在肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)表面,与肾小球内皮细胞和肾小球基膜一同构成肾小球滤过屏障。足细胞呈星状,其多个胞体伸长,这种结构称为足突(foot processes,FPs);邻近足细胞的足突相互穿插交错,交错形成的裂隙由一段拉链状的裂孔隔膜(slit diaphragm,SD)连接。与SD组成密切相关的Nephrin、NEPH1、FAT、Podocin和Ephrin B1等蛋白可跨膜在FPs内进行信号分子传递。FPs内含有密集的细胞骨架网络,其中肌动蛋白丝不仅与SD连接,还与GBM上的锚蛋白如α3β1整合素(α3β1 integrin)、肌营养不良蛋白聚糖等连接。因此,足突与足突之间、足细胞与基底膜之间形成结构独立又高度依赖的存在模式,这种模式对于维持足细胞的结构稳定性以及相互之间的信息交流至关重要。足细胞通过释放血管内皮生长因子A来调节肾小球内皮细胞的生长、存活、分化及其通透性。

随着DN的发生发展,肾小球及足细胞的结构、功能均发生改变。糖尿病会诱导肾小球出现适应性的病理变化:GBM增厚、系膜细胞肥大和增殖、系膜基质沉淀等。同时,足细胞会发生骨架重排、足突融合甚至消失,细胞间紧密连接形成增加,狭缝隔膜长度减少,甚至足细胞减少[4]。这些细胞功能障碍会导致肾小球内毛细血管通透性的变化和GFB的损伤,并最终导致蛋白尿[5]。因此足细胞损伤是DN及其进展的关键环节。足细胞损伤引起的肾小球病变也是局灶阶段性肾小球硬化、微小病变性肾病、狼疮性肾炎和膜性肾病等疾病的主要病理特征[6-7](图1)。

图1 足细胞损伤的主要病理特征Fig.1 Pathological features of podocyte injury

2 DN状态下足细胞损伤机制

2.1 糖毒性

高血糖是DN发生发展最直接、最主要的危险因素之一。机体在高葡萄糖环境中发生胰岛素抵抗导致葡萄糖代谢异常,部分葡萄糖不依赖胰岛素即可进入细胞,它激活了细胞内的糖代谢旁路途径,如多元醇(polyol)途径和己糖胺途径,这导致山梨醇和二酰基甘油等有毒中间代谢产物的积累[8],而过多的山梨醇氧化成果糖[葡萄糖被醛糖还原酶还原后转化为山梨醇,山梨醇在山梨醇脱氢酶的作用下又氧化生成果糖,其过程均依赖于还原型辅酶Ⅱ(NADPH)],引起还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD)的值升高,产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),引起细胞内氧化应激(oxidative stress,OS)水平升高。此外,果糖可促进晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)生成,大量的AGEs与其受体RAGE结合通过激活不同的细胞内信号通路,例如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK)和核因子kappa-B(NF-κB)来诱导OS以及炎症级联反应等,这些病理进程会导致大部分肾脏细胞结构损伤和功能障碍。总之,过量的葡萄糖内流激活细胞信号通路,其中包括二酰基甘油-蛋白激酶C(DAG/PKC)通路、AGEs途径、多元醇通路和己糖胺通路。这些因素相互作用,从而加重炎症过程,促进了糖尿病状态下肾小球硬化的发生发展[9]。

当使用醛糖还原酶抑制剂后,明显减轻了DN小鼠基底膜增厚、系膜基质沉淀和足突融合等病理损伤,并提高了足细胞相关蛋白Nephrin和Podocin表达[10]。有趣的是,Qi等[8]回顾某项大型队列研究,对病程超过50年的1型糖尿病患者按有无DN并发症进行分组,取肾活检组织标本进行蛋白质组学检测并进行比较分析后得出结论,没有DN并发症的糖尿病患者中存在更高水平的葡萄糖代谢酶,这些代谢酶与糖酵解通量增加密切相关,是糖尿病患者肾小球免受高糖毒性损害的主要因素。研究者们为了证明这个结论,不管是在STZ诱导的糖尿病小鼠的肾皮质,还是体外暴露于高糖环境的足细胞,测得的PKM2或PKM1的蛋白质水平均没有明显变化。然而,在体内实验中,PKM2激动剂的干预逆转了DN小鼠模型中糖代谢异常和线粒体功能障碍;在体外实验中,PKM2敲低的足细胞不管是处在高糖环境还是低糖环境都出现了明显的DNA断裂[8,11]。可见,在DN高血糖的情况下,除了减少葡萄糖的摄入,在一定程度上增加葡萄糖代谢通量以减少糖毒性损伤是值得进一步探索的DN治疗策略。

2.2 脂毒性

越来越多的证据表明,脂质代谢异常是DN发生发展的重要机制之一。过度的脂质积累导致的肾脏细胞损伤被称为肾脂毒性。临床试验与动物实验均显示,DN模型血浆中含有高浓度的胆固醇[12]、游离脂肪酸、甘油三酯等[13-14]。足细胞对脂质变化高度敏感,足细胞中脂质过度积累可导致线粒体OS、肌动蛋白细胞骨架重塑、胰岛素抵抗、自噬损伤以及炎症反应,最终可导致足细胞肥大、脱离和死亡[7]。

足细胞脂质的积累归因于脂肪的生成增加和分解减少。与脂肪生成相关的一些基因是固醇调节元件结合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins,SREBP)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARγ),而PPARα则起诱导脂肪分解的作用[15]。游离脂肪酸过量时,会经由膜蛋白CD36被运送到细胞内而后合成大量的甘油三酯,与多余的胆固醇一同积聚在脂滴中,这种过量的脂通量对一些重要的细胞器(如线粒体、内质网和溶酶体等)的形态和功能造成直接的损伤,引起线粒体OS、溶酶体损伤以及内质网应激,最终导致细胞凋亡[15],这对于能量消耗大的足细胞来说无疑是致命的损伤。AdipoRon是一种脂联素受体激动剂,脂联素通过诱导腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化和PPARα表达来介导脂肪酸代谢。在给予AdipoRon处理后的db/db小鼠肾皮质组织中观察到p-AMPK(Thr172)和PPARα等蛋白上调,以及SREBP-1c和iNOS等蛋白水平下调,证明了AdipoRon可以通过改善脂质代谢来预防DN[16]。同样,在高糖暴露下的人类肾小球内皮细胞和小鼠足细胞中,AdipoRon被证实可通过激活细胞内CaMKKβ/p-LKB1(Ser431)/p-AMPK(Thr172)/PPARα通路和下游信号传导,减少高糖诱导的OS和细胞凋亡,改善细胞功能[17]。G蛋白偶联受体43(GPR43)是参与胆固醇代谢的转录后调节因子,GPR43基因敲除后的糖尿病小鼠肾脏中胆固醇明显减少。与体内实验类似,在体外用GPR43 siRNA处理高糖高脂模型足细胞后发现,GPR43可通过调节早期生长反应蛋白1(EGR1)途径上调低密度脂蛋白受体(LDLR)对胆固醇的摄取以及抑制自噬介导的胆固醇降解,促进足细胞损伤[12]。可见,脂质代谢稳态对于足细胞功能完整性至关重要。

2.3 氧化应激

OS一直被认为是DN发展的主要机制之一,与糖脂代谢失衡和血流动力学改变密切相关[18]。OS是导致肾脏结构和功能的破坏的重要因素之一,肾小球内皮细胞、系膜细胞、足细胞和肾小管上皮细胞在内的多种肾细胞的损伤都与OS相关[19]。在DN中,AGEs的积累刺激ROS的产生,当抗氧化物水平不足以消耗ROS时,多余的ROS则容易引起DNA损伤,从而激活p53及其下游途径以诱导细胞凋亡。线粒体是ROS生成的主要场所,线粒体中的DNA损伤导致线粒体功能障碍,导致足细胞足突融合、凋亡且脱落以及足细胞相关蛋白的减少[20]。

沉默调节蛋白1(Sirtuin1,SIRT1)和AMPK是维持细胞和全身能量稳态的重要营养感受器,通常在营养过剩时沉默,在营养消耗的情况下被激活。AMPK与SIRT1二者具有协同作用,共同发挥抗氧化特性,在保护线粒体功能中起着重要的作用。体外实验显示,在高糖环境中培养的足细胞p-AMPK/AMPK比值明显降低,线粒体发生肿胀、裂变等变化,线粒体功能明显降低[21]。白藜芦醇(一种SIRT1激活剂)可通过激活SIRT1/PGC-1α途径介导线粒体保护作用,降低高糖刺激诱导的足细胞氧化损伤和凋亡[22]。葡萄籽原花青素B2作为一种强抗氧化剂,在体外研究中被证实可通过激活AMPK/SIRT1/PGC-1α途径降低足细胞中ROS水平和减轻线粒体损伤[23]。可见,通过激活抗氧化途径来降低ROS水平、保护线粒体功能是保护DN中足细胞免受OS损伤的必要途径之一。

2.4 炎症

在DN病理条件下,长期的OS和糖脂代谢中间产物的积累可诱发过度的炎症反应,慢性炎症已被公认为是DN向ESRD发展的促进因素[24]。在高糖环境下,内皮细胞释放白细胞粘附分子和趋化因子,包括血管细胞粘附分子-1、细胞间粘附分子-1和单核细胞趋化蛋白1等[20],募集单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞浸润肾组织并促进炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1、TGF-β和NF-κB)的产生,这些因子在促进糖尿病肾损伤中起关键作用[25-26]。在DN患者的肾组织活检中观察到,巨噬细胞在趋化因子上调时浸润肾组织,并证实巨噬细胞在肾脏中的积累是慢性肾脏疾病进展的突出特征,与肾小球滤过率下降和预后不良密切相关[27]。

从机制上来说,JAK2/STAT3/SOCS1信号通路、AMPK/SIRT1/NF-κB信号通路、TGF-β/Smad信号通路和MAPK/NF-κB信号通路是典型的炎症信号通路,炎症相关信号通路被激活时各通路之间往往发生串扰反应,在介导糖尿病肾损伤中起关键的作用。多项研究表明,当上述炎症信号通路被抑制时,DN模型中的炎症因子水平明显下调,足细胞相关蛋白Podocin和Nephrin显著上调,肾小球病理变化明显改善[25,28-32]。

2.5 自噬

众所周知,自噬对肾脏中所有主要细胞(包括足细胞、系膜细胞和内皮细胞)的细胞稳态具有显著影响。自噬的主要作用是降解蛋白质、去除受损的细胞器以及调节糖脂代谢平衡。在自噬过程中,p62与泛素化的蛋白质结合,再与自噬小体膜上的LC3-Ⅱ蛋白形成复合物,一同在自噬溶酶体内被降解。足细胞是高度分化的细胞,没有分裂能力,因此细胞内的自噬降解系统对于维持足细胞稳态至关重要。在DN的早期,肾脏暴露于高糖、炎症和OS等刺激下,出于自我保护可出现自噬水平上调,但后期由于溶酶体损伤导致自噬过程受到抑制,自噬受损导致肾脏细胞损伤,出现GBM增厚、系膜扩张、足细胞丢失和大量蛋白尿[33]。有研究发现,50周龄的OLETF大鼠出现大量蛋白尿伴有足细胞丢失,在其足细胞中观察到有大量受损的溶酶体,并检测到p62蛋白水平升高,这些特征均提示自噬水平不足[34]。

在雷帕霉素(mTOR)成员中,雷帕霉素复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)通过调节ULK1磷酸化抑制自噬途径,抑制细胞分解代谢。白藜芦醇可以显著降低STZ诱导的DN大鼠肾脏组织的p-mTOR/mTOR水平,并上调p-ULK1/ULK1以及自噬相关蛋白(Bclin1,LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ)水平,通过改善脂质代谢紊乱、抑制细胞凋亡和激活自噬来阻止足细胞进一步损伤[35-36]。mTOR上游的两大营养素感受信号AMPK和SIRT1在DN中受到抑制。AMPK和SIRT1是自噬的正向调节因子,一旦被激活,SIRT1可通过去乙酰化自噬相关蛋白来促进自噬。此外,SIRT1可以与AMPK和mTOR通路串扰,调节能量代谢和促进自噬,减少细胞凋亡[37]。由此可见,在糖尿病条件下,自噬在维持足细胞稳态方面起着关键作用。

2.6 表观遗传

越来越多的证据表明,与DN的病理改变相关的基因不仅受到经典信号通路的调控,而且还受到表观遗传机制的调控[38]。表观遗传机制是指在不改变基础DNA序列的情况下,与DN相关的基因和表型对长期不利刺激因素存在的环境作出相应改变,且这种改变具有遗传性。其主要涉及到染色质组蛋白修饰、DNA甲基化和非编码RNA方面。这也可以解释为什么对DN进行血糖控制后,症状仍然会持续存在,这种现象被称之为代谢记忆[38-39]。表观遗传学在与DN发生和发展相关的病理生理过程的调节中起着关键作用,包括肾小球病变、肾纤维化、慢性炎症和其他病理特征[40]。

SIRT6是Ⅲ类NAD依赖性组蛋白去乙酰化酶,有研究发现,SIRT6特异性缺失加剧了DN患者足细胞缺失和蛋白尿症状,并通过体内外实验证实SIRT6是通过降低Notch1和Notch4启动子区域中的组蛋白H3K9乙酰化水平,从而降低了足细胞中的炎症反应和细胞凋亡,改善了肌动蛋白细胞骨架结构紊乱,上调了Nephrin和Podocin水平,同时也恢复了足细胞自噬相关蛋白水平[41]。在足细胞中,转录因子Sp1与NF-κB p65相互作用,Sp1/NF-κB p65复合体直接参与DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,Dnmt1)调控。一项实验证明,在使用DNA甲基化抑制剂治疗db/db小鼠后,蛋白尿明显减少,肾小球肥厚、系膜基质扩张和足细胞损伤得到了明显改善。另外高糖诱导下的足细胞中Dnmt1、Sp1和NF-kBp65的表达明显增加,而在Dnmt1特异性敲除后又抑制了足细胞SD蛋白的减少[42]。同样的,非编码RNA的表达失调也与DN的发展密切相关。miR-192是第1个被报道与DN相关的特异性miRNA[43],miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-126-3p、miR-192-5p、miR-214-3p和miR-342-3p也在随后的研究中陆续被发现与DN的损伤机制密切相关[40]。值得注意的是,miRNA既受DNA甲基化和组蛋白修饰的调节,部分miRNA又可对DNMTs和组蛋白脱乙酰酶的水平进行调节,这些基于遗传学的证据对于阐释DN的发病机制至关重要(图2)。

3 结语

DN发展的病理机制十分复杂,涉及遗传因素、表观遗传因素和环境之间的相互作用。尽管足细胞损伤在肾小球疾病中的地位已被证实,但是目前靶向足细胞损伤的治疗方法仍然十分缺乏。足细胞和足细胞相关分子有可能作为生物标志物用于糖尿病肾损伤的早期诊断。所以,充分了解足细胞损伤的机制,找到参与足细胞损伤的重要基因分子和通路。对于后续探索靶向足细胞的治疗方法至关重要。

图2 足细胞的损伤机制Fig.2 Mechanism of podocyte injury