牙龈卟啉单胞菌诱导选择性自噬接头蛋白SQSTM1/p62高表达在食管鳞癌中的临床意义及预后价值*

郭艺博， 刘怡文， 杨海军， 代宁涛， 孙 蔚，米优嘉， 张家铭， 周福有， 原 翔， 高社干△

1河南科技大学第一附属医院(临床医学院)肿瘤医院，河南省微生态与食管癌防治重点实验室，河南省肿瘤表观遗传重点实验室，洛阳 471003 2 河南科技大学基础医学院，洛阳 471003 安阳市肿瘤医院 3病理科 4胸外科，安阳 455000

食管癌的发病率与病死率极高，90%以上食管癌为食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[1]。本团队前期研究证实，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)感染可促进ESCC的恶性进展[2]，但其具体致病机制尚不明确。自噬作为真核细胞内降解错误折叠蛋白、清除受损细胞器及外来病原微生物的重要生物学过程，参与多种肿瘤的发生发展[3]。其中，选择性自噬接头蛋白sequestosome-1(SQSTM1/p62)作为自噬过程的关键调节因子，其高表达可为病原微生物在宿主细胞内长期定植提供有利条件[4]。幽门螺旋杆菌及丙型肝炎病毒可通过激活p62，阻断自噬流，加速胃癌和肝癌的恶性进展[5-6]。同时，p62的高表达与乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤的分化程度、淋巴结转移、化疗抵抗以及不良预后密切相关[7-8]。由此推测Pg可能通过诱导p62高表达，导致ESCC自噬受阻，促进其恶性进展。

本研究首先通过Pg感染ESCC细胞，初步分析Pg对p62的诱导效应。并检测ESCC组织中Pg感染及p62的表达情况，进一步分析该诱导效应与患者临床病理特征及生存期的相关性，为ESCC治疗提供新思路和治疗手段。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2011～2014年在河南省安阳市肿瘤医院行食管癌根治术的186例ESCC患者为研究对象。研究经医院伦理委员会审核批准，患者知情同意。纳入标准：①经病理首次诊断为ESCC且未合并其他肿瘤；②术前未接受过放化疗或免疫治疗且肿瘤直径>5 mm；③术后常规化疗；④病例资料信息齐全。排除标准：①经病理非首次诊断为ESCC，或非ESCC，或合并其他肿瘤；②术前接受过放化疗或免疫治疗且肿瘤直径≤5 mm；③术后未采用常规化疗；④病例资料信息不全。

最终，因4例病理诊断为食管腺癌、3例术前接受过放化疗而被排除，共计179位ESCC患者被纳入研究。其中包括男性104例，女性75例；年龄60岁及以上100例，60岁以下79例；101例有吸烟史，78例无吸烟史；95例有饮酒史，84例无饮酒史；104例低分化，75例中-高分化；130例肿瘤侵及外膜，49例未侵及外膜；107例有淋巴结转移，72例无淋巴结转移；103例Ⅲ/Ⅳ，76例Ⅰ/Ⅱ。

1.2 主要试剂与仪器

人ESCC细胞系KYSE150及293T细胞系(中国博谷生物科技有限公司)；Pg菌株ATCC 33277及Pg兔抗人单克隆抗体(美国路易斯维尔大学口腔生物实验室捐赠)；GAM肉汤培养液、5%脱纤维绵羊血、1%氯化血红素、0.1%维生素K、柠檬酸抗原修复液、DAB显色液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL发光显影液、结晶紫、EBSS(Earle’s balanced salt solution)、PBS(中国索莱宝公司)；锇酸、醋酸铀、柠檬酸铅(上海默克公司)；单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC，中国索莱宝公司)，Lysotracker Red(中国索莱宝公司)；慢病毒包装试剂盒(中国Cyagen公司)；RPMI-1640及DMEM培养液、胎牛血清(美国Gibco公司)；IHC试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)；CCK-8试剂盒、p62和GAPDH兔抗人单克隆抗体与二抗(美国Abcam公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；光学显微镜(日本尼康公司)；透射电子显微镜(英国OPTON公司)；电镜超薄切片机(美国LEICA公司)，共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)；厌氧工作站(美国COY公司)；凝胶成像系统及酶标仪(美国BIO-RAD公司)。

1.3 慢病毒载体敲低KYSE150细胞p62表达

293T细胞由含10%胎牛血清(56℃热灭活30 min)的DMEM培养液于37℃，5%CO2的培养箱常规培养，待密度为60%～70%时，开始转染。将待包装的p62基因沉默shRNA质粒(5′-GCATTGAAGTTGATATCGAT-3′)与慢病毒包装质粒混合后，与转染试剂混合为DNA-EndoFectin混合物。将其加入293T细胞，常规培养后更换为新鲜培养液。加入滴度增强剂Titer Boost，48 h后收取病毒上清，过滤去除细胞碎片。待KYSE150细胞密度至50%～60%时，加入病毒上清进行转染。嘌呤霉素筛选培养，2周后提取细胞蛋白质，通过Western blot方法检测p62敲降效率[9]。

1.4 Western blot检测

新鲜提取细胞蛋白后，用BCA蛋白定量试剂盒检测浓度并定量。每泳道上样30 μg总蛋白，在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，并转移至PVDF膜上。经脱脂奶粉封闭后，依次孵育p62抗体(1∶2000)及二抗(1∶2000)。采用ECL发光显影液检测目的蛋白条带，凝胶成像系统采集图像，应用Image Lab软件对蛋白条带灰度值进行测定，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值比值为目的蛋白相对表达量[10]，实验重复3次。

1.5 Pg感染ESCC细胞

Pg在GAM肉汤培养液(含5%脱纤维绵羊血、1%氯化血红素和0.1%维生素K1)中，于37 ℃，85%N2、10%H2和5%CO2的厌氧工作站中常规培养。利用革兰染色法及哥伦比亚血琼脂板检测Pg的纯度。选取活力较好的Pg菌液(A600nm=1～2)，待细胞密度为60%～70%时，以MOI=10的比例将Pg加入细胞培养液，作用不同时间[10]。

1.6 透射电子显微镜观察亚细胞结构

收集感染及未感染Pg的KYSE150细胞，经2.5%戊二醛固定2 h，将其包裹在2.5%琼脂中制成1 mm3的小块，再置于锇酸中固定。随后分别于50%、70%、90%、95%和100%乙醇中梯度脱水，每次10 min。收集脱水后的细胞样品于树脂及丙酮混合液中渗透，将样品包埋，经超薄切片机制片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色后于透射电子显微镜下拍摄[11]。

1.7 共聚焦显微镜拍摄

将各组细胞接种于共聚焦皿(1000个/皿)常规培养24 h。将细胞换液后加入MDC自噬体特异性染料及Lysotracker Red溶酶体特异性染料，于37℃孵育1 h。在共聚焦显微镜下拍摄并定量分析MDC及Lysotracker Red的共定位情况[12]。

1.8 细胞划痕实验

将各组细胞以每孔1×105个接种于6孔板中常规培养。待细胞融合至70%～80%，用无菌枪头在培养孔内划线并记录位置，PBS洗涤后常规培养。每3小时对每孔同一位置拍照记录。应用Image J软件测量不同时间点各组划痕内空白区域大小，并计算迁移面积[13]。实验重复3次。

1.9 平板克隆实验

将各组细胞以1000个/孔接种于6孔板中常规培养，每3天换液1次。于第15天固定细胞，用1%结晶紫染色后拍照留存，并记录各组细胞克隆形成数[14]。实验重复3次。

1.10 CCK-8实验

将各组细胞以1000或1500个/孔置于96孔板(每孔100 μL)中，常规培养24 h后每孔加入CCK-8试剂10 μL，具体步骤参照试剂盒说明书，最后以酶标仪测定450nm处吸光度值[15]。实验重复3次。

1.11 免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色及结果判读

每例患者取2张常规石蜡包埋的ESCC组织连续切片(片厚2.5 μm)，经脱蜡、水化、抗原修复、过氧化物酶阻断剂及山羊血清封闭后，分别加入Pg(1∶1000)及p62抗体(1∶200)孵育；PBS清洗后经山羊抗鼠/兔聚合物孵育、SP封闭、DAB显色、苏木精复染、梯度乙醇脱水，二甲苯透明后以中性树胶封片。结果判读：连续切片中癌细胞胞质出现浅黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为Pg感染或p62表达阳性。阳性对照、阴性对照及免疫组化评分标准参照本课题组前期研究[16]，Pg感染阳性判定标准为：≤3分定义为阴性，>3分且≤12分定义为阳性；p62阳性判定标准为：≤3分定义为阴性，>3分且≤12分定义为阳性[17]。每例2张连续切片中Pg及p62同时判定为阳性的组织样本定义为Pg诱导p62高表达阳性，作为Pg+p62阳性组；不满足2张连续切片同时阳性的归为阴性组，以Pg+p62阴性组表示。

1.12 统计学方法

2 结果

2.1 Pg可诱导ESCC细胞中自噬体累积及p62高表达

为检测Pg感染对ESCC细胞自噬水平的影响，通过透射电子显微镜观察Pg感染后KYSE150细胞中自噬体数量，结果(图1A)显示：与对照组相比，Pg感染后KYSE150细胞内自噬体数量显著增多(P<0.05)，提示Pg感染后可引起KYSE150细胞发生自噬。随后通过Western blot检测Pg感染KYSE150细胞不同时间(6、9、12、24 h)对各组细胞中p62、Beclin1、LC3蛋白表达量的影响，结果(图1B、1C)显示：Pg感染组p62蛋白表达量显著高于Pg未感染组(P<0.05)，且感染组中p62表达量随Pg感染时间延长而逐渐增高，24 h增高最为显著，提示Pg感染可诱导KYSE150细胞中p62高表达；与对照组相比，Pg感染组中Beclin1蛋白表达量随Pg感染时间延长而逐渐减少，而LC3表达量随Pg感染时间延长而逐渐增多，提示Pg感染可诱导KYSE150细胞中Beclin1低表达、LC3高表达，见图1D、1E。

Pg-：未感染Pg的对照组KYSE150细胞；Pg+：感染Pg的KYSE150细胞；A：透射电镜观察Pg感染后KYSE150细胞中自噬体数量；B：Western blot法检测Pg对KYSE150细胞中自噬蛋白p62、Beclin1、LC3表达量的影响；C，D，E：单因素方差分析比较各组细胞中p62、Beclin1、LC3蛋白的表达差异；与Pg未感染组比较，* P<0.05图1 Pg可诱导KYSE150细胞中自噬体累积及p62高表达Fig.1 Pg can induce accumulation of autophagosome and high expression of p62 in KYSE150 cells

2.2 Pg通过诱导p62高表达引起ESCC细胞自噬进程受阻

对KYSE150细胞分别进行EBSS饥饿、Pg感染及敲低p62表达处理，经MDC及Lysotracker Red共染后于共聚焦显微镜下拍摄。实验分为7组：①对照KYSE150细胞(对照组)，②EBSS饥饿组，③Pg感染6 h组，④Pg感染24 h组，⑤p62敲低+EBSS饥饿组，⑥p62敲低+Pg感染6 h组，⑦p62敲低+Pg感染24 h组。共聚焦显微镜下检测各组细胞中MDC与Lysotracker Red的共定位情况，结果(图2A、2B)显示：与对照组相比，Pg感染6 h组MDC与Lysotracker Red共定位量显著升高(P<0.05)，提示在Pg感染初期能够诱导KYSE150细胞发生自噬，与EBSS饥饿诱导自噬的结果类似；与Pg感染6 h组相比，Pg感染24 h组MDC与Lysotracker Red共定位量显著减弱(P<0.05)，提示Pg持续感染可能使自噬受阻；在p62敲降的KYSE150细胞中，与EBSS饥饿组比较，p62敲低+EBSS饥饿组中MDC与Lysotracker Red共定位量明显减弱(P<0.05)，提示p62敲除后KYSE150细胞自噬减弱；敲低p62表达后，无论Pg感染时间长短，均无法诱导KYSE150细胞自噬增强(P>0.05)，提示Pg感染后KYSE150细胞自噬水平的变化与p62密切相关。

①：对照组KYSE150细胞；②：EBSS饥饿组；③Pg感染6 h组；④Pg感染24 h组；⑤p62敲低+EBSS饥饿组；⑥p62敲低+Pg感染6 h组；⑦p62敲低+Pg感染24 h组；A：共聚焦显微镜检测各组细胞MDC与Lysotracker Red的共定位情况；B：单因素方差分析比较各组细胞中MDC与Lysotracker Red的共定位量；与①组比较，1)P<0.05；与②组比较，2)P<0.05；与③组比较，3)P<0.05图2 Pg通过诱导p62高表达引起KYSE150细胞自噬进程受阻Fig.2 Pg causes autophagy inhibition in KYSE150 cells by inducing high expression of p62

2.3 Pg通过诱导p62高表达增强ESCC细胞的增殖及迁移能力

对KYSE150细胞进行Pg感染及敲低p62表达处理，实验分为4组：①对照KYSE150细胞(对照组)，②Pg感染组(感染24 h)，③p62敲低组，④p62敲低+Pg感染组。检测各组细胞中p62蛋白表达量，结果(图3A、3B)显示：与对照组相比，p62敲低组中p62蛋白表达量显著降低(P<0.05)，而Pg感染24 h组中p62蛋白表达量显著增高(P<0.05)，提示Pg可诱导ESCC细胞中p62高表达，与2.1中结果一致。平板克隆(图3C、3D)、CCK-8(图3E、3F)及划痕实验(图3G、3H)结果显示：与对照组及Pg感染组相比，p62敲低组及p62敲低+Pg感染组中细胞的增殖及迁移能力显著减弱(均P<0.05)，提示p62蛋白的敲降抑制了ESCC细胞的增殖及迁移能力；与对照组相比，Pg感染24 h组中细胞的增殖及迁移能力显著增强(均P<0.05)，提示Pg感染可增强ESCC细胞的增殖及迁移能力；与p62敲低+Pg感染组相比，Pg感染组中细胞的增殖及迁移能力显著增强(P<0.05)，而p62敲低组中细胞的增殖及迁移能力无明显差异(P>0.05)，提示Pg可通过诱导p62高表达增强ESCC细胞的增殖及迁移能力。

①：对照KYSE150细胞(对照组)；②Pg感染组；③p62敲低组；④p62敲低+Pg感染组；A，B：Western blot法检测各组细胞中p62蛋白的表达量及统计分析；C，D：平板克隆实验检测各组细胞的增殖能力；E，F：CCK-8实验检测各组细胞的增殖能力；G，H：划痕实验检测各组细胞的迁移能力；与①组比较，1)P<0.05；与②组比较，2)P<0.05图3 Pg诱导p62高表达增强KYSE150细胞的增殖及迁移能力Fig.3 Pg enhances the proliferation and migration ability of KYSE150 cells by inducing high expression of p62

2.4 Pg感染与ESCC组织中p62高表达相关

对179例ESCC患者的食管癌及相应癌旁组织进行石蜡包埋、连续切片，采用IHC检测。结果(图4)显示：ESCC组织中可见癌细胞胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒，为Pg感染阳性，而癌旁组织中Pg染色多为阴性，Pg阳性率明显低于ESCC组织(P<0.05，表1)；p62主要定位于癌细胞胞质，为棕黄色或棕褐色颗粒，且癌旁组织p62的表达阳性率明显低于ESCC组织(P<0.05，表2)；同时，ESCC组织中Pg感染与p62高表达具有显著一致性(P<0.01，表3)。

图4 IHC检测ESCC与癌旁组织中Pg感染与p62表达情况(×400)Fig.4 Detection of Pg infection and p62 expression in ESCC tissues and adjacent normal tissues by IHC(×400)

表1 ESCC患者食管癌及癌旁组织中Pg阳性率比较[例(%)]Table 1 Comparison of the positive rate of Pg infection between cancer tissues and adjacent normal tissues from ESCC patients[n(%)]

表2 ESCC患者食管癌及癌旁组织中p62表达情况比较[例(%)]Table 2 Comparison of the positive rate of p62 expression between cancer tissues and adjacent normal tissues from ESCC patients[n(%)]

表3 ESCC组织中Pg感染与p62表达的一致性分析[例(%)]Table 3 Consistency analysis between Pg infection and p62 expression in ESCC tissues[n(%)]

2.5 Pg感染及p62表达与ESCC患者生存期相关性

结果见图5及表4。179例ESCC患者术后5年生存率及中位生存时间分别为26.26%和(28.00±2.22)月。其中Pg感染阳性患者5年生存率为16.25%，中位生存时间为(20.00±1.12)月，显著低于阴性患者的5年生存率(34.34%)及中位生存时间[(34.00±2.49)月](均P<0.05)；p62表达阳性患者5年生存率为20.00%，中位生存时间为(21.00±2.31)月，显著低于p62表达阴性患者(均P<0.05)；Pg感染与p62表达共阳性患者(Pg+p62阳性组)5年生存率为15.38%，中位生存时间为(19.00±1.10)月，显著低于非共阳性患者(Pg+p62阴性组，均P<0.05)。此外，与Pg感染阳性或p62表达阳性的患者比较，二者共阳性的患者(Pg+p62阳性组)5年生存率降低最为显著。

A：ESCC患者术后5年生存曲线；B：Pg感染阳性与阴性患者术后5年生存曲线；C：p62表达阳性与阴性患者术后5年生存曲线；D：Pg+p62阳性组与阴性组患者术后5年生存曲线图5 ESCC患者术后5年Kaplan-Meier生存曲线Fig.5 5-year Kaplan-Meier survival curve of ESCC patients after surgery

表4 不同组ESCC患者的生存时间(月)Table 4 Survival time of ESCC patients in each group(month)

2.6 Pg感染及p62表达与ESCC患者临床病理特征相关性

按表3中Pg感染与p62表达情况对179例ESCC患者进行分组，分析Pg感染与p62表达与患者临床病理特征的相关性。结果显示(表5)，Pg感染、p62阳性表达及Pg+p62表达共阳性均与患者性别、吸烟、饮酒、肿瘤分化程度、淋巴结转移及临床分期有关(表5，均P<0.05)。

表5 Pg感染及p62表达与ESCC患者临床病理特征的相关性[例(%)]Table 5 Correlation between Pg infection，p62 expression and clinicopathological features of ESCC patients[n(%)]

3 讨论

ESCC是常见的消化道恶性肿瘤，具有显著的地域性[18]，早期无明显症状，临床上大多确诊即为中晚期，且5年生存率极低[19]。因此，探明ESCC的病因，寻找早期诊断指标与有效预防措施尤为重要。

资料显示，病原微生物感染与肿瘤的发生发展密切相关[20]，Pg作为一种条件致病菌，广泛定植于口腔和消化道内，其慢性感染及长期定植可促进食管癌[21]、肺癌[22]及结肠癌[23]等多种肿瘤的恶性进展。我们前期研究已证实，Pg在上消化道肿瘤中呈上高下低的分布状态，且可长期定植于ESCC细胞[16]，同时Pg感染阳性的患者生存期显著缩短[24]。本研究结果与之一致，提示Pg感染促进了ESCC的恶性进展。

自噬是细胞内降解受损细胞质组分以维持其稳态的一种重要生理活动。资料显示，病原微生物入侵时，宿主细胞将其包裹入自噬体，运输至溶酶体进行清除[25]，随着病原微生物的长期感染，为逃避自噬的清除作用，病原微生物演进出多种抑制自噬体形成与成熟的机制。SARS-CoV-2病毒可通过抑制SNAP29与syntaxin17的相互作用而阻断自噬体与溶酶体融合[26]，而柯萨奇病毒可通过调控自噬蛋白plekhm1而阻碍自噬体向溶酶体转运[27]。研究显示，Pg同样可以在血管内皮细胞及单核巨噬细胞中诱导自噬的发生[28-29]，且随着Pg的持续感染，可通过干扰自噬体与溶酶体融合的过程，为自身长期定植提供有利条件[30]。p62为自噬过程中的关键调控因子，其表达水平的高低与自噬流的发生发展密切相关。狂犬病毒可通过诱导p62高表达，抑制自噬体成熟，导致自噬体大量堆积，并利用自噬体中待降解的蛋白为自身供能，从而长期定植，且病毒载量与p62表达水平呈正相关[31]；结核分枝杆菌可通过诱导p62的组蛋白超甲基化，引起自噬流受阻，促进细菌在宿主细胞内生存[32]。此外，p62表达水平的高低还与多种肿瘤的恶性进展密切相关[33]。p62高表达的结直肠癌患者生存期显著缩短[34]，且p62缺失的食管癌患者化疗敏感性显著增强[35]，p62已成为多种肿瘤的重要标志蛋白及关键治疗靶点。

本研究发现，Pg感染初期可通过p62介导ESCC细胞发生自噬，而随着Pg持续感染，可进一步通过诱导p62高表达导致ESCC细胞自噬进程受阻，为自身于ESCC细胞中长期定植提供有利条件并增强ESCC细胞增殖及迁移能力，同时在ESCC组织中二者表达具有显著一致性。对179例ESCC患者术后5年生存分析发现Pg感染及p62表达阳性的患者5年生存率及中位生存时间均显著低于阴性患者，其中二者共阳性的患者(Pg+p62阳性组)5年生存期缩短最为显著，提示Pg感染及p62高表达均可影响ESCC患者生存期，且二者共阳性对患者生存期影响最大。通过χ2检验分析Pg+p62阳性组患者与其临床病理特征相关性，发现Pg+p62阳性组患者多为吸烟、饮酒的男性，提示长期吸烟、饮酒的男性患者感染Pg的风险增高，并伴随分化程度低，有淋巴结转移及临床分期晚，此时Pg对p62的诱导效应逐渐加强，提示该诱导效应与ESCC的恶性进展密切相关。

综上所述，Pg可通过诱导ESCC细胞p62高表达，干扰其自噬进程，为自身长期定植提供有利条件，促进ESCC恶性进展。由于病原微生物感染与肿瘤细胞自噬及恶性进展是一个相互交织、涉及多因素的复杂过程，因此Pg与自噬相关的致病机制仍有待进一步探索，也有待相关的体内动物实验进一步验证。但打破Pg在ESCC细胞内持久定植的现状，并有效控制p62表达，对于ESCC临床防治策略的制定及有效延缓ESCC恶性进展，延长患者生存期而言具有重要的科学理论意义。