基于网络药理学的“丹参-红花药对”抗骨质疏松分子机制研究*

张罡瑜， 何 琪， 林瑞婷， 温晓雯， 杨均政，2，钟 莎 ， 曾嘉旭， 王海彬， 陈 鹏△

广州中医药大学 1第一临床医学院 2岭南医学研究中心中医骨伤科实验室 3第一附属医院关节骨科，广州 510405

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身性骨骼疾病，其特点是单位体积骨量降低，骨组织微结构退化，导致骨脆性增加而易于发生骨折[1]。OP可发生于各年龄段，以绝经后女性及老年男性多见，随着我国人口老龄化进展，OP发病率、医疗资源及资金投入将不断上升。据预测，到2035年我国骨质疏松性骨折每年发生数将达460万例，每年经济负担将增至200亿美元[2]。目前西医对OP的治疗主要集中于抑制骨吸收、促进骨形成的药物疗法，但存在副作用较大、用药时间长等局限性[3]，因此寻求更有效的中医药疗法对防治OP具有重要意义。

丹参[4]是唇形科丹参(Salviamiltiorrhiza)的干燥根和根茎，味苦，性微寒，具有活血祛瘀、通经止痛等功效，常用于治疗胸痹心痛、疮疡肿痛等病症。现代药理学研究表明[5]，丹参的主要成分是以丹酚酸B为代表的丹参总酚酸类及以丹参酮ⅡA为代表的丹参酮类成分，其具有抗氧化、抗炎、改善微循环等药理作用。红花[4]是菊科植物红花(CarthamustinctoriusL)的干燥花，味辛，性温，具有活血通经、散瘀止痛等功效，常用于治疗跌仆损伤、疮疡肿痛、瘀滞腹痛等病症。现代药理学研究表明，红花的主要成分是以羟基红花黄色素A为代表的查尔酮类、黄酮类及生物碱类，具有抗骨质疏松、抗炎、止痛、抗氧化等药理作用[6]。丹参、红花虽性味不同，但同有活血祛瘀、通经止痛的功效，皆入心、肝经，是经典活血化瘀的相须药对。基于药性组合对丹参-红花药对的研究表明，丹参-红花药对组合使用可通过参与脂质代谢、免疫调节、磷脂酶代谢等过程发挥活血祛瘀止痛的作用[7]。据此，丹参-红花药对在从瘀论治疗OP方面具有较大的治疗潜力和优势，进一步研究丹参-红花对OP的潜在有效成分及作用机制，有助于促进丹参、红花在OP治疗上的应用，丰富OP治疗选择，提高临床疗效。

“网络药理学(network pharmacology)”概念由英国药理学家Andrew L Hopkins教授于2007年首次提出[8]。网络药理学通过构建“药物-基因-靶点-疾病”网络关系，从网络层面多层次、多角度地预测药物的药理学机制，揭示药物对疾病多靶点、多通路的作用机制，有助于从整体角度论证中药及复方中药多成分、多途径的治疗优势，揭示中药及复方中药治疗疾病的潜在活性成分及作用靶点，可见网络药理学符合中医学的整体观念，可为中医药的研究、发展提供新的思路及技术支持。

1 资料与方法

1.1 丹参、红花化学成分信息获取及收集

使用TCMSP平台(version 2.3，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)收集丹参、红花两味药物的化学成分，对其主要化合物成分的药物动力学(Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，ADME)性质进行评估[9]。限制条件为口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18，筛选出丹参、红花中具有良好口服生物利用度和类药性的化合物。

1.2 丹参、红花化学成分靶点的获取及收集

将TCMSP中筛选所得的丹参、红花的化学成分，借助PubChem平台(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取药物成分的化学结构，并保存为Smiles格式。Swiss数据库(http：//www.swisstargetprediction.ch/)可基于分子的2D和3D结构与已知配体的相似度准确地预测活性成分的靶点。在使用过程中，将物种设置为“人类”，将平台的靶点预测结果进行收集整理。

1.3 疾病靶点的获取及收集

Disgenet是一个综合的基因-疾病相关关系数据库，它结合文献检索和数据挖掘技术，对多种疾病进行了相关性分析，使用者可通过输入特定基因获取与基因相关的疾病信息，或输入疾病名称获得与该疾病相关的基因[10]。通过数据库检索关键词“Osteoporosis”获取与骨质疏松相关靶标基因，最后使用Venny 2.1.0(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将药物成分相关的靶点和疾病靶点进行匹配映射，获得丹参-红花活性成分的作用靶点并绘制维恩图。

1.4 药物-活性成分-关键作用靶点网络的构建

将丹参、红花的活性成分所对应的靶点基因和癌症相关的靶标基因进行匹配，获得两者的共同基因即为丹参-红花治疗OP的关键靶点。使用Cytoscape软件(version 3.6.1，http：//www.cytosc-ape.org)构建“药物-活性成分-关键作用靶点基因”关系网络。网络中节点(node)代表丹参(DS)-红花(HH)药对活性成分与关键靶点基因；网络中边(edge)用来连接单味药与活性成分、活性成分与关键靶点基因。

1.5 关键靶点蛋白相关作用网络的构建

String数据库(https：//string-db.org/Version 10.5)是用于预测蛋白质-蛋白质相互作用的生物学数据库，其数据是通过大量实验检测和生物信息学方法得到的[11]。将丹参-红花关键靶点导入String数据库，物种选择为“人类”，获得蛋白互作信息，将结果以TSV格式导出。将所得数据导入Cytoscape软件进行可视化，绘制蛋白相互作用网络图。设置网络中节点大小和颜色深浅反映Degree值大小，边的粗细反映Combine score大小。

1.6 关键靶点生物功能注释及通路分析和可视化

利用Clue GO插件，对关键靶点进行生物过程富集分析，并根据重要程度绘制占比饼状图。David数据库(DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/)是一个高通量生物学信息注释数据库，能为大规模的基因或蛋白提供系统全面的生物学功能注释信息，进而挖掘其生物学意义。将丹参-红花的潜在作用靶点导入David数据库，物种限定“人类”，对靶点进行KEGG信号通路富集分析[12]。利用omicshare平台(http：//www.omicshare.com/)作图。

2 结果

2.1 丹参-红花的潜在活性成分及其分子结构

通过TCMSP数据库检索丹参、红花的化合物并根据OB≥30%和DL≥0.18进一步筛选，得到丹参的潜在活性成分65个，红花潜在活性成分22个，表1列举数据库生成的丹参、红花各前20位活性成分。

表1 丹参-红花中潜在活性成分及其OB和DL值Table 1 Potential active compounds in DS-HH and the OB and DL parameters

续表1

2.2 潜在作用靶点预测

将Swiss数据库得到的预测靶点去除重复后，得到丹参活性成分作用靶点200个，红花活性成分靶点147个。通过检索Disgenet数据库得到OP疾病靶点478个。使用Venny 2.1.0(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将药物靶点和疾病靶点相映射并绘制维恩图(图1)，获得共同基因36个(表2)，其中包括丹参活性成分关键靶点基因26个，红花活性成分关键靶点基因28个，两药物之间共有的关键靶点基因为18个。这提示丹参与红花在治疗过程中既可通过单独的靶点发挥作用，又可通过共同的作用靶点协同发挥抗骨质疏松作用。

DS：Danshen，丹参；HH：Honghua，红花图1 丹参-红花靶点基因与疾病靶点基因的匹配Fig.1 Matching of target genes between DS-HH and disease

表2 关键靶点基因归属Table 2 Identification of key target genes

2.3 药物-活性成分-关键作用靶点网络构建与分析

将活性成分和潜在作用靶点导入Cytoscape软件进行网络构建及可视化(图2)。结果表明，成分Poriferast-5-en-3beta-ol、Poriferasterol、Flavoxanthin、Beta-sitosterol、Stigmasterol、Luteolin、α-amyrin、5，6-dihydroxy-7-isopropyl-1，1-dimethyl-2，3-dihydrophenanthren-4-one、Przewalskin a、Salviolone、Phytoene、Phytofluene、Beta-carotene、Kaempferol等能与5个及5个以上的靶点相连接，可被认为是丹参-红花治疗OP的主要活性成分。连接度大于2倍中位数6的靶点基因为TERT、ESR1、ESR2、CYP19A1、ALOX15、ALOX12、STAT1，在丹参-红花治疗OP的过程中具有重要意义。

DS：丹参；HH：红花；绿色节点代表药物，红色节点代表活性成分，黄色节点代表关键作用靶点图2 丹参-红花药对活性成分、关键作用靶点网络Fig.2 Drugs-components-targets network of active ingredients of DS-HH

2.4 关键靶点基因蛋白质相互作用网络分析

将丹参-红花治疗OP的36个潜在的关键靶点基因导入String数据库获取蛋白质相互作用关系，再将获得数据导入Cytoscape软件绘制蛋白关系网络(图3)。节点的大小反映Degree数值大小，节点的Degree数值越大，节点越大。以节点连接之间边的粗细反映Combine score。Combine score越大，边越粗。其中ESR1、MAPK3、ERBB2、CYP19A1、CYP2B6、PPARG、AR、CYP1A1、MAPK14、IGF1R、PGR、NR3C1、MMP2、STAT1、HSD17B1、CYP17A1的Degree值均大于中位数7，靶点ESR1、MAPK3、ERBB2、CYP19A1、CYP2B6的Degree值在中位数7的2倍以上，表明这些基因在网络中具有重要地位，这些靶点基因在丹参-红花治疗OP中具有重要意义，可作为丹参-红花药对有效成分作用的靶点基因。

图3 丹参-红花的蛋白质相互作用网络Fig.3 Protein interaction network of DS-HH

2.5 关键靶点基因生物功能及通路分析

GO注释结果显示，丹参-红花药对的36个潜在关键靶点基因涉及Mammary gland branching involved in pregnancy(妊娠期乳腺分支，4个靶点)、Negative regulation of posttranscriptional gene silencing(转录后基因沉默的负调控，3个靶点)、Negative regulation of gene silencing by RNA(RNA对基因沉默的负调控，3个靶点)、Prostate gland development(前列腺生长，3个靶点)、epoxygenase P450 pathway(环氧化酶P450通路，3个靶点)、Branching involved in mammary gland duct morphogenesis(乳腺导管形态形成分支，4个靶点)等41个生物过程，表明丹参-红花通过参与调控多种生物学过程而发挥治疗OP的作用。占比饼状图显示，丹参-红花药对治疗OP主要涉及的生物过程为：Mammary gland branching involved in pregnancy(妊娠期乳腺分支，24.39%)、Negative regulation of posttranscriptional gene silencing(转录后基因沉默的负调控，21.95%)、Arachidonic and metabolic process(花生四烯酸代谢过程，14.63%)和Regulation of lipid catabolic process(脂质代谢调控过程，12.20%)。见图4。

图4 丹参-红花活性成分关键靶点的GO生物学过程富集分析Fig.4 Enriched gene ontology terms for GO biological processes of key targets from active ingredients of DS-HH

KEGG通路富集分析显示，丹参-红花的关键基因靶点主要富集的通路为Ovarian steroidogenesis(卵巢类固醇生成)、Steroid hormone biosynthesis(甾类激素生物合成)、Ptolactin signaling pathway(催乳素信号通路)、Adherens junction(粘着连接)、Bladder cancer(膀胱癌)、Estrogen signaling pathway(雌激素信号通路)等，表明丹参-红花的活性成分靶点分布于不同的通路，可通过各通路协调发挥抗OP作用(图5)。

图5 丹参-红花活性成分关键靶点的KEGG通路富集分析Fig.5 Enriched KEGG pathways of key targets from main active ingredients of DS-HH

3 讨论

随着人口老龄化进展，OP发病率呈上升趋势，严重影响患者心理健康及生活质量，成为我国面临的重要公共健康问题，因此对OP治疗方法的研究与探索在不断进行。研究表明[13]，OP的中西医结合治疗比单一西医治疗可更有效地控制和改善病情。中医学将OP归为“骨痹”、“骨痿”等范畴，治疗多遵循补益肝肾、健脾益气、活血化瘀等治法。研究表明，血瘀是OP发病的关键病理基础[14]，活血化瘀中药对于OP的治疗呈现出多靶点、多环节、多通路等特点[15]，具有独特治疗优势。实验研究表明，丹参提取物具有促进成骨标志物基因表达、增加成骨细胞活性、诱导破骨细胞分化、改善局部微循环等作用，从而实现抑制骨丢失、促进骨形成、提高骨密度、降低骨质疏松导致的骨折倾向；红花提取物具有降低破骨细胞生成相关基因的表达、促进骨形成相关基因表达、促进骨矿化等作用，从而实现增加骨量，改善骨生物力学参数[16-19]。

本研究通过筛选获得丹参-红花药对的潜在活性成分共87个，并在此基础上挖掘出36个关键作用靶点。药物-活性成分-关键作用靶点网络分析显示，Poriferast-5-en-3beta-ol、Poriferasterol、Flavoxanthin、Beta-sitosterol、Stigmasterol、Luteolin、α-amyrin、5，6-dihydroxy-7-isopropyl-1，1-dimethyl-2，3-dihydrophenanthren-4-one、Przewalskin a、Salviolone、Phytoene、Phytofluene、Beta-carotene、Kaempferol等有效成分能作用于网络中的多个靶点，显示了丹参-红花药对治疗OP具有多成分、多靶点的作用特点。Chiou等[20]研究表明Kaempferol(山奈酚)和Luteolin(木樨草素)均可诱导雌激素受体α(ERα)磷酸化，提高Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素、骨桥蛋白mRNA的表达，从而促进成骨细胞的分化，山奈酚还可促进成骨细胞的矿化过程。蛋白质相互作用网络分析中，ESR1、MAPK3、ERBB2、CYP19A1、CYP2B6在丹参-红花药对治疗OP中起重要作用。活性成分与靶点之间以及靶点与靶点之间的共同作用、共同调节是丹参-红花药对治疗OP的重要作用机制。

GO注释结果显示，丹参-红花的36个潜在关键靶点基因富集的生物学功能包括妊娠期乳腺分支、转录后基因沉默的负调控、RNA对基因沉默的负调控、前列腺生长、环氧化酶P450途径、乳腺导管形成的分支等。KEGG通路富集主要包括通路：卵巢类固醇生成、甾类激素生物合成、催乳素信号通路、粘着连接、膀胱癌通路、雌激素信号通路。相关的作用机制为①雌激素信号通路：生长发育和衰老过程中性激素缺乏是骨脆性发病的关键因素[21]。雌激素作为卵巢分泌的类固醇激素之一，可以通过雌激素受体α或者激活Wnt/β-Catenin信号通路改善人骨髓间充质干细胞成骨分化的能力[22-23]。研究表明，17β-雌二醇(E2)通过阻断脂联素诱导的p38 MAPK的活化，抑制脂联素调节的OPG/RANKL表达，进而抑制破骨细胞生成[24]。②环氧合酶途径：花生四烯酸代谢的环氧合酶途径可参与软骨内骨化的调节[25]。环氧合酶通过催化花生四烯酸的过氧化产生类前列腺素[26]，促进骨与软骨代谢，在骨代谢和骨折愈合中起重要作用。③细胞色素P450途径：细胞色素P450是肝脏混合功能氧化酶系(MFO)的主要成分。肝酶诱导剂能诱导细胞色素P450酶系统，使其活性增加，促使维生素D分解代谢加速最终使骨钙入血，骨密度减低[27]。另外，研究表明细胞色素P450的亚型CYP1A1参与烃类致癌物的代谢[28]，同时丹参能诱导CYP1A1 mRNA的表达[29]，这与本研究结果显示的丹参-红花可作用于多个癌症通路相似。从富集结果分析可知，丹参-红花不仅能通过直接作用于骨代谢相关信号通路，如Wnt/β-Catenin、OPG/RANKL/RANK、MAPK信号通路，而且通过相关通路相互联系，多靶点、多方向、多系统地发挥抗OP作用，这也恰恰体现了中医药治疗疾病的特点——治病求本、标本兼治，也进一步说明中医多靶点、多方面进行综合干预的可行性和优势。

综上所述，网络药理学结果显示丹参-红花药对治疗OP涉及多个分子、通路和过程，成功预测了丹参和红花对治疗OP的可能机制，揭示了丹参和红花抗骨质疏松的多成分、多靶点、多途径、多信号特点，为进一步的机制探讨和实验设计的优化等提供了重要的依据。同时，本文为相关机制的研究提供了思路和方法，尤其是中药及其复方针对某种特定疾病的机制分析，也为临床OP治疗提供了参考。