鞘氨醇激酶1修饰的脂肪来源间充质干细胞对组织工程化骨成骨效果的影响*

吴景冬,李皓桓

武汉大学人民医院骨关节外科，武汉 430060

鞘氨醇激酶1修饰的脂肪来源间充质干细胞对组织工程化骨成骨效果的影响*

吴景冬,李皓桓△

武汉大学人民医院骨关节外科，武汉 430060

目的 研究鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPK1)修饰的脂肪来源间充质干细胞(adipose tissue-derived stromal cells，ADSC)对组织工程化骨成骨能力的影响。方法 将从SD大鼠脂肪细胞中分离提取的ADSC分为对照组(CON组)与实验组(SPK1组)，分别感染10 MOI的CON和SPK1慢病毒，在感染病毒14 d后，分别使用茜素红和油红O染色，检测A595 nm和A490 nm以判定成骨、成脂能力，检测两组成骨细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性变化。构建SD大鼠股骨缺损模型，在CON与SPK1两组ADSC与β磷酸三钙陶瓷(β-TCP)结合后，将组织工程骨填压至缺损处，4、6周后X线检测大鼠骨缺损修复情况，Western blot检测SPK1、骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein，BMP7)表达变化。结果 流式细胞仪检测CON和SPK1慢病毒感染效率分别为94.4%、94.9%；CON和SPK1组SPK1蛋白相对表达量分别为(0.73±0.10)vs.(1.29±0.17)，P<0.05；CON和SPK1组A595 nm分别为(0.20±0.02)vs.(0.41±0.01)，A490 nm分别为(0.72±0.01)vs.(0.51±0.02)，均P<0.05。CON与SPK1的ALP活性分别为(1.42±0.09)vs.(2.68±0.09)，P<0.01。在骨缺损修复中，第4周SPK1组大鼠骨缺损处形成的高密度组织面积显著大于CON组，在第6周时SPK1组大鼠骨缺损治愈，而CON组则尚有缺损。CON和SPK1组在感染病毒48 h后BMP7相对表达量分别为(1.13±0.16)vs.(4.46±0.23)，P<0.05。结论 SPK1修饰的ADSC体外、体内成骨能力增强，其机制可能与BMP7激活相关。

鞘氨醇激酶1； 脂肪来源间充质干细胞； 组织工程化骨； 成骨能力； 骨形态发生蛋白7

各种形式的骨缺损如骨肿瘤的切除[1]、牙槽骨缺损[2]等在临床上常见，而相应的修复也一直是临床亟待解决的问题，机体骨组织的修复是一个多因素作用的复杂过程，主要与骨形态发生蛋白家族(bone morphogenetic proteins，BMP)有关[3]，近年来应用组织工程化骨治疗成为一个新的方向。脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived stromal cells，ADSC)是一种起源于脂肪组织的干细胞，与间充质干细胞相似，ADSC能够分化为成骨、软骨与脂肪细胞，与此同时ADSC还具有容易获取、体外易扩增培养的优点[4]，因此ADSC在组织工程骨中得到广泛的应用。然而ADSC实际应用中依然存在新生血管少、成骨能力不足等缺点[5]，因此运用特定的基因修饰ADSC来达到增强成骨能力成为研究的热点。

鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPK1)是一种在鞘磷脂代谢通路中发挥关键作用的激酶。多种细胞因子如白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)[6]、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)[7]、血管内皮生长因子[8]等能够通过SPK1调节鞘氨醇-1-磷酸进而改变骨组织代谢，包括抑制破骨细胞的分化成熟、破骨细胞及其前体细胞迁移[9]，SPK1甚至能够通过力学刺激直接作用于骨细胞从而诱导骨组织重建[10]。因而，运用SPK1修饰的ADSC对于组织工程化骨成骨的改善具有很好的前景。

1 材料与方法

1.1 材料

SD大鼠购自华中科技大学同济医学院实验动物学部，IgG、CD19、CD34、CD11b、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105抗体购自美国eBioscience公司，SPK1、BMP7和GAPDH一抗均购自美国Cell Signal Technology公司，SPK1慢病毒过表达质粒购自美国Vector BioLabs，β-TCP钙磷陶瓷购自上海组织工程中心，碱性磷酸酶活性检测试剂盒购自碧云天公司。

1.2 ADSC的分离提取与鉴定

SD大鼠颈椎脱臼处死后，分离腹股沟脂肪组织，并使用剪刀尽量剪碎；加入5 mL 0.1%的Ⅰ型胶原酶，37℃摇床振摇45 min；DMEM+10%FBS完全培养液清洗3次，细胞种于相应大小的平皿中，48 h后换液；得到的贴壁细胞消化后，PBS洗2次，分别标记IgG、CD19、CD34、CD11b、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105流式抗体，冰上孵育30 min，流式检测荧光阳性细胞比率。

1.3 CON和SPK1慢病毒包装纯化

CON组载体使用空载pcdh-cmv-mcs-ef1-puro骨架质粒构建，SPK1组载体使用pcdh-cmv-mcs-ef1-puro骨架质粒构建，CON和SPK1过表达慢病毒质粒与PMD2G、psPAX2质粒共转染至293T细胞中，分别收集培养24、36、48 h病毒上清，PEG沉淀纯化得到CON和SPK1慢病毒。

1.4 ADSC感染慢病毒与分组

大鼠ADSC分为CON和SPK1组，分别感染10 MOI(病毒∶细胞=10∶1)CON和SPK1过表达慢病毒，14 d后检测ADSC成骨、成脂能力的变化。

1.5 蛋白印迹检测

采用Western blot法，收集感染CON和SPK1慢病毒的ADSC细胞，使用RIPA裂解，并加入蛋白上样缓冲液得到蛋白样本，上样量为20 μg，浓缩胶以80 V电泳50 min，分离胶以100 V电泳2 h，湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入SPK1(1∶200)、BMP7(1∶200)和GAPDH(1∶200)一抗，4℃孵育过夜，二抗(1∶1 000)孵育2 h，ECL液显影，Quantity One 1-D分析软件对蛋白质印迹条带进行定量测定。目的蛋白相对表达量=目的蛋白测定值/ GAPDH，实验均重复3次，取平均值。

1.6 ADSC成骨与成脂诱导染色

CON和SPK1组ADSC分别培养于成骨、成脂诱导液中，成骨诱导液配方为α-MEM+ 10%FBS、50 μmol/L抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油和100 nmol/L地塞米松，每3天换液，14 d后使用茜素红染色确定成骨细胞。成脂诱导液配方为HD-DMEM+10%FBS、1 μmol/L地塞米松、10 μg/mL胰岛素、200 μmol/L吲哚美辛和0.5 mmol/L IBMX，14 d后使用油红O染色确定成脂细胞。所有诱导均设立复孔，在茜素红和油红O染色后，使用分光光度计分别检测595 nm与490 nm波长处的吸光度值以确定成骨、成脂能力的变化。

1.7 ADSC细胞与β-TCP复合

将CON组和SPK1组ADSC取1×106个细胞，悬浮于30 μL完全培养液中，随后接种于消毒后的β-TCP上，37℃、5% CO2静置4 h后，待细胞贴附于β-TCP，将材料放置于96孔板中，隔2～3 d换液。

1.8 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性检测

实验按照试剂盒说明书进行，细胞感染病毒后14 d裂解取上清，加入到显色底物溶液中，并设立空白对照，37℃孵育5～10 min，每孔加入100 μL反应终止液终止反应，检测405 nm波长处吸光度值来判定ALP活性，实验重复3次，取平均值。

1.9 大鼠骨损伤模型的构建以及ADSC疗效评估

60只SD大鼠随机分为CON、SPK1组、未处理组和单用β-TCP组，每组15只，使用3 mg/kg水合氯醛麻醉后，在股骨处做一纵切口，并分离肌肉以暴露股骨，使用外科锥做一2 mm×2 mm的股骨缺损，深至骨髓可见，并将组织工程骨即CON或SPK1细胞与材料的复合物填充至缺损处，同时设立未做任何处理组以及单用β-TCP组，缝合切口。4、6周后处死大鼠，使用X线检测骨缺损的改变。

1.10 统计学方法

使用SPSS 20.0软件进行分析，两组间均数比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SD大鼠ADSC的分离提取及纯度测定

SD大鼠ADSC中CD19 0.128%、CD34 0.099%、CD11b 0.031%、CD45 0.132%、HLA-DR 0.017%，均为阴性；而CD73 98.4%、CD90 98.4%、CD105 97.9%，均为阳性，见图1。

图1 流式细胞仪检测ADSC中CD19、CD34、CD11b、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105阳性细胞的比例Fig.1 Percentages of CD19+，CD34+，CD11b+，CD45+，HLA-DR+，CD73+，CD90+，CD105+ ADSC detected by flow cytometry

2.2 CON和SPK1慢病毒的包装纯化与感染复数测试

流式细胞仪检测CON和SPK1组红色荧光蛋白RFP阳性细胞比例以确定感染效率，结果表明，CON组感染效率为94.4%，SPK1为94.9%(图2A)；Western blot检测SPK1蛋白水平的变化，结果表明在CON和SPK1组的蛋白相对表达量分别为(0.63±0.10)vs.(1.29±0.17)，P<0.05(图2B)。

2.3 SPK1过表达对ADSC成骨、成脂能力的影响

相对于CON组，SPK1组ADSC分化偏向成骨，而成脂则相对变少(图3A)；CON和SPK1 ADSC成骨能力A595 nm分别为(0.20±0.02)vs.(0.41±0.01)，P<0.05，成脂能力A490nm分别为(0.72±0.01)vs.(0.51±0.02)，P<0.05(图3B)；进一步测定成骨细胞标志酶ALP活性的变化，结果表明CON与SPK1 ALP活性分别为(1.42±0.09)vs.(2.68±0.09)，P<0.01(图3C)。

2.4 SPK1过表达增强组织工程化骨成骨能力

CON和SPK1组ADSC与β-TCP结合后将组织工程化骨填压到SD大鼠股骨缺损处，在4、6周后处死SD大鼠，X线检测大鼠骨缺损的修复状况后发现，在第4周时，SPK1组大鼠骨缺损处形成的高密度组织面积显著大于CON组，在第6周时SPK1组大鼠骨缺损基本治愈，而CON组则尚有缺损，未处理组与单用β-TCP组无明显修复痕迹(图4A)。同时CON和SPK1感染ADSC 48 h使用Western blot检测BMP7变化后发现，CON和SPK1组相对表达量分别为(1.13±0.16)vs.(4.46±0.23)，P<0.05(图4B)。

ADSC细胞分别感染10 MOI的CON和SPK1慢病毒48 h后，A：流式细胞仪检测RFP阳性细胞比例；B：Western blot检测SPK1的表达图2 SPK1过表达慢病毒感染效率及表达水平检测Fig.2 Measurement of infection efficiency and expression of SPK1 over-expression lentivirus

A：使用茜素红和油红O染色检测CON与SPK1组ADSC成骨、成脂的变化;B：在A595 nm和A490 nm波长处检测CON与SPK1组ADSC成骨成脂能力;C：CON与SPK1组ALP活性比较；*P<0.05 **P<0.01图3 SPK1过表达对于组织工程化骨细胞成骨、成脂的影响Fig.3 Impact of SPK1 overexpression on osteogenic and adipogenic ability of tissue-engineered bone cells

A：复合物植入到骨缺损的SD大鼠中，分别在4、6周处死大鼠，X线检测骨缺损的修复情况，箭头所示为骨缺损处修复情况;B：48 h后Western blot检测CON与SPK1组ADSC中BMP7的表达图4 SPK1对ADSC体内成骨的影响Fig.4 Effect of SPK1 on osteogenesis of ADSC in vivo

3 讨论

在骨损伤的治疗中，应用组织工程化骨已经能够起到很好的效果。组织工程化骨的构建过程为，首先得到分离纯化的种子细胞如间充质干细胞，体外诱导成骨并扩大培养后，种植于合适的支架材料中，并将细胞与支架材料的复合物植入到骨缺损部位[11]。影响组织工程化骨的主要因素为种子细胞、生长因子及支架材料[12]，其中种子细胞起到至关重要的作用。组织工程化骨中的细胞可分为分化成熟的细胞及未分化的干细胞两种，在分化成熟的细胞中，细胞的可用性极其有限，因此，研究主要集中于间充质干细胞的应用[13]。对于组织工程化骨的改进主要集中于通过种子细胞的选择、支架材料的选择、运用基因修饰、细胞因子等方法更有效地促进种子细胞的成骨分化[14]。ADSC近年来在组织工程化骨中的作用已被广泛认可，然而在实际的应用中，依然存在着成骨能力弱、新生血管少等问题。因此，针对特定基因进行修饰，改善种子细胞如ADSC的生物学指标以完善组织工程化骨成为研究的热点，如在Lieberman等[15]的研究中，BMP-2过表达腺病毒转染大鼠基质细胞后，能够修复自体股骨8 mm大小的节段性缺损。目前对于ADSC的基因修饰主要集中于BMP及其相关蛋白，针对BMP蛋白的修饰尽管能够改善ADSC的成骨特性[16]，单一BMP的修饰如BMP2、BMP7的修饰并不能够收到满意的效果[17]，而联合表达BMP2、BMP7则会增加可变因素从而限制临床的应用，因此寻求新的靶点修饰ADSC成为必要。

在本研究中，首先从SD大鼠腹股沟脂肪组织中分离提取ADSC，在使用流式细胞仪对ADSC常见标志物进行检测后，确定了分离的ADSC具有很高的纯度，同时包装、纯化SPK1过表达慢病毒，在使用10 MOI感染ADSC后，分别通过流式细胞仪、Western blot确定了SPK1慢病毒对于ADSC具有很高的感染效率，且能够在蛋白水平显著促进SPK1的表达。ADSC在感染SPK1病毒14 d后分别使用茜素红和油红O染色检测ADSC成骨、成脂能力的变化，结果表明SPK1的表达增高使得ADSC成骨能力增加、成脂能力减弱，ADSC成骨、成脂平衡得到改变，SPK1 ADSC在A595 nm的升高和A490 nm的降低也印证了这一点，而SPK1组成骨细胞标志酶ALP活性也明显高于CON，进一步证实了ADSC-SPK1组成骨能力的增加，因此，SPK1对ADSC体外成骨能力的促进得到证实。随后将CON和SPK1 ADSC与β-TCP复合，使用SD大鼠骨缺损模型观察成骨效果后发现，从第4周开始，SPK1组大鼠骨缺损修复明显优于CON组，且在第6周SPK1组完全愈合，而CON组骨缺损依然存在，进一步证实了SPK1组骨缺损修复优于CON组，在ADSC感染CON和SPK1慢病毒48 h时，使用Western blot检测BMP7的变化后发现，BMP7表达显著上调，提示SPK1对于骨缺损修复的促进可能与BMP7的上调有关。

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(2016-09-23 收稿)

Impact of SPK1 Modified ADSC on Osteogenesis of Tissue Engineered Bone

Wu Jingdong，Li Haohuan△

DepartmentofBoneandJointSurgery，RenmingHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China

Objective To investigate the impact of sphingosine kinase 1(SPK1) modified adipose tissue-derived stromal cells(ADSC)on tissue engineered bone osteogenesis.Methods ADSC cells isolated from SD rat fat cells were divided into CON group and SPK1 group，and then the cells were respectively infected with 10 MOI CON and SPK1 lentivirus for 48 h.The infection efficiency was confirmed by using flow cytometry.Alizarin red and oil red O was used to stain the cells 14 days after ADSC infection，and osteogenic and adipogenic ability was evaluated by detectingA595 nmandA490 nm.In the meantime，the activity change of alkaline phosphatase(ALP)was detected.The SD rat femoral defect model was created，and then after combining ADSC with β-TCP，the tissue engineered bone was pressed to the defect site.The repairment of bone defect was detected by X-ray in 4，6 weeks.After infection of CON and SPK1 virus，bone morphogenetic protein(BMP7)expression in ADSC of these two groups was detected.Results The infection efficiency of CON and SPK1 lentivirus was 94.4%vs.94.9% respectively by flow cytometry.The SPK1 protein expression level in CON group and SPK1 group was (0.73±0.10)vs.(1.29±0.17)(P<0.05).TheAvalue of CON and SPK1 group at 595 nm was (0.20±0.02)vs.(0.41±0.01)(P<0.05)，respectively.TheAvalue of CON and SPK1 group at 490 nm was (0.72±0.01)vs.(0.51±0.02)(P<0.05)，respectively.The expression level of ALP in CON and SPK1 group was (1.42±0.09)vs.(2.68±0.09)(P<0.01)，respectively.In the repairment of bone defect，high density tissue at rat bone defect was significantly larger in SPK1 group than in CON group in 4 weeks，and in 6 weeks，bone defect of SPK1 group was healed，but CON group still had defect.The expression level of BMP7 in CON and SPK1 group was (1.13±0.16)vs.(4.46±0.23)(P<0.05)，respectively，48 h after infection.Conclusion SPK1 modified ADSC has an enhanced osteogenesis abilityinvitroandinvivo，which was related to the activation of BMP7.

sphingosine kinase 1； adipose tissue-derived stromal cells； tissue engineered bone； osteogenesis； bone morphogenetic protein 7

*国家自然科学基金资助项目(No.81171760)

吴景冬，男，1976年生，副主任医师，E-mail：377181369@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：lihaohuan@139.com

R681.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.011