PI3K/Akt途径在MMC诱导的肝干细胞凋亡中的作用*

刘晖杰，许 丹，彭 荣

1湖北省文理学院附属襄阳市中心医院肿瘤科，襄阳 441021 2湖北省武汉市中医院消化内科，武汉 430014 3湖北省宜城市医院肿瘤科，宜城 441400

实验研究

PI3K/Akt途径在MMC诱导的肝干细胞凋亡中的作用*

刘晖杰1，许 丹2，彭 荣3

1湖北省文理学院附属襄阳市中心医院肿瘤科，襄阳 4410212湖北省武汉市中医院消化内科，武汉 4300143湖北省宜城市医院肿瘤科，宜城 441400

目的 探讨PI3K/Akt途径在丝裂霉素(mitomycin，MMC)诱导的肝干细胞凋亡中的作用。方法 用MMC刺激大鼠肝干细胞，观察MMC刺激不同时间(6、12、24 h)对WB-F334细胞凋亡率的影响，以及不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)的MMC对WB-F334细胞的细胞毒作用，加入磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)抑制剂曲西立滨(triciribine，API-2)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)抑制剂SB203580后观察MMC对WB-F334细胞凋亡率的影响，探讨MMC调节WB-F334细胞凋亡的信号途径。结果 MMC对WB-F334细胞凋亡率的影响随作用时间延长而上升(P<0.05)；与对照组比较，不同浓度的MMC对肝干细胞有明显细胞毒作用，且随着MMC浓度的升高而上升；Western blot检测结果显示：MMC刺激WB-F334细胞15 min后MAPK、Akt均发生磷酸化，且随着时间延长而减弱，60 min后磷酸化消失，说明p38 MAPK及PI3K/Akt途径能够被MMC激活；当MMC处理的细胞加入了p38 MAPK抑制剂后，抑制剂处理组中细胞的凋亡率与MMC处理组并无显著差异(P>0.05)，说明MAPK途径对MMC诱导WB-F334细胞凋亡并没有明显的作用；而当MMC处理的细胞加入了Akt抑制剂后，Akt抑制剂处理组中细胞的凋亡率与MMC处理组相比显著降低(P<0.05)，表明PI3K/Akt途径对MMC诱导WB-F334细胞凋亡有明显的作用。结论 MMC能够刺激肝干细胞WB-F334发生凋亡，而其诱导凋亡的作用是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。

肝干细胞； 细胞凋亡； 丝裂霉素； 磷脂酰肌醇-3激酶； 蛋白激酶B； 信号通路

之前的研究表明肝干细胞可促进肝组织损伤后再生，增强机体的肝功能自修复效果。肝组织内许多细胞因子能够调控肝干细胞分化、增殖[1]，可显著促进肝干细胞再生、生长及凋亡，因此一旦这些因子的表达出现异常，很可能影响肝功能并引起肝脏疾病。

丝裂霉素(mitomycin，MMC)由链霉菌提取，化学结构含有苯醌、乙酰亚胺基及氨甲酰，可与DNA链形成交联，从而抑制细胞DNA复制[2]，可诱导胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、非小细胞肺癌及乳腺癌等肿瘤细胞凋亡。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)作为诱导细胞凋亡主要信号途径之一，其功能可能受到MMC调控[3]，但具体作用机制尚不清楚。本文通过研究PI3K/Akt和丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)信号途径对MMC诱导大鼠肝干细胞凋亡的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

从美国Sigma公司购置大鼠肝干细胞WB-F334、MMC、p38 MAPK抑制剂SB203580、PI3K/Akt抑制剂曲西立滨(triciribine，API-2)。DMEM培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司，DNM-9602酶标分析仪购自上海精密仪器仪表有限公司，流式细胞仪购自美国贝克曼公司，MTT试剂盒购自上海博谷生物科技有限公司。

1.2 细胞凋亡率检测方法

WB-F334细胞按照每孔2×106个细胞密度接种于6孔板，分别加入0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL的MMC，对照组滴入等体积含10%胎牛血清DMEM培养液，各组细胞滴入0.25%胰酶消化后，收集细胞制成单细胞悬液，1 200 r/min离心5 min，弃培养液；冷PBS洗细胞2次，1 200 r/min离心5 min，收集细胞；用400 μL 1× 结合缓冲液悬浮细胞，浓度大约为1×106/mL；在细胞悬浮液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混匀后于4℃避光条件下孵育15 min；加入10 μL PI后轻轻混匀于4℃避光条件下孵育5 min，2 h内于流式细胞仪中检测，实验重复3次。

1.3 细胞毒作用检测方法

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)法测定细胞毒作用，WB-F344细胞按照5×105/孔置入96孔板，每组设置3个复孔，待细胞贴壁后，加入0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL的MMC，对照组滴入等体积含10%胎牛血清DMEM培养液，作用6、12、24 h后，置于37℃、5%CO2孵箱内孵育24 h后，每孔滴入MTT 10 μL，37℃反应6 h后，每孔再滴入盐酸异丙醇100 μL，混匀、静置20 min，DNM-9602酶标分析仪检测各孔A570nm值。

1.4 Western blot检测信号分子磷酸化

取各组培养细胞调整细胞至2×106个，用磷酸盐缓冲液洗3次，2 min/次，滴入600 μL高效蛋白裂解液(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)，置于冰上30 min，细胞刮取器刮取细胞，4℃下15 000 r/min离心30 min，取上清液(细胞蛋白溶解成分)。选择十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺进行常规凝胶电泳，分离胶浓度为10%；100 V下以PVDF膜转膜，5%BSA封闭60 min后，滴入兔抗鼠Anti-PI3K或p38 MAPK一抗(用API-2或SB203580按照1∶2 000稀释)中反应1 h，TBST洗3次，10 min/次。置辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(应用API-2或SB203580按照1∶5 000稀释)二抗中止反应l h，TBST洗3次，10 min/次。ECL系统检测、胶片显影。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 MMC作用不同时间WB-F334细胞凋亡率的变化比较

MMC作用6 h的WB-F334细胞凋亡率(9.18±10.45)%，12 h的WB-F334细胞凋亡率(32.67±12.58)%，24 h的WB-F334细胞凋亡率(58.42±12.09)%，均高于对照组(2.44±8.73)%，且随时间的增加而上升(均P<0.05)。

2.2 不同浓度的MMC对肝干细胞的细胞毒作用比较

分别用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的MMC刺激大鼠的肝干细胞24 h，空白对照组和各浓度组的A值分别为0.835、0.601、0.574、0.498、0.369、0.305；与对照组比较，不同浓度的MMC对肝干细胞有明显细胞毒作用，且随着MMC浓度的升高而上升(图1)。

图1 不同浓度的MMC对肝干细胞的细胞毒作用比较Fig.1 Comparison of cytotoxicity of different concentrations of MMC on liver stem cells

2.3 MMC对WB-F334细胞不同信号途径的激活

通过Western blot法检测各信号分子的激活，结果如图2所示。MMC刺激WB-F334细胞15 min后，与刺激前相比较，细胞中磷酸化MAPK、Akt(p-MAPK，p-Akt)蛋白的表达水平均显著升高，提示MAPK和Akt蛋白均被活化；而且激活作用随着时间延长而减弱，刺激30 min后，p-MAPK及p-Akt的表达水平呈现明显下降的趋势，直至60 min后p-MAPK及p-Akt几乎不表达，说明MMC可以在短时间内有效激活WB-F334细胞中的p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路。

图2 MMC对WB-F334细胞MAPK及PI3K/Akt信号通路的激活Fig.2 MMC activated MAPK and PI3K/Akt signaling pathway in WB-F334 cells

2.4 p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路在MMC诱导的WB-F334细胞凋亡中的作用

为了进一步研究p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路在MMC诱导的WB-F334细胞凋亡中的作用，我们将细胞分为4个组别，分别为未处理组(control)，MMC处理组(MMC)，MMC处理组+ p38 MAPK抑制剂SB203580组(SB)及MMC处理组+PI3K/Akt抑制剂API-2组(API-2)，以研究p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路在MMC诱导的WB-F334细胞凋亡中的作用。首先，为了验证SB203580及API-2的效果，我们使用Western blot方法比较加入API-2及SB203580后MMC处理组WB-F334细胞中p-MAPK及p-Akt的表达情况。如图3所示，与未加抑制剂相比，当加入了SB203580后，MMC刺激的WB-F334细胞中未见p-MAPK的表达，提示SB203580显著抑制了MAPK的磷酸化，而加入API-2对WB-F334细胞中MAPK的磷酸化并未产生影响；而当加入了API-2后，WB-F334细胞中Akt的磷酸化程度明显减弱，而加入SB203580对WB-F334细胞中Akt的磷酸化并未产生影响。

接下来我们研究了p38 MAPK及PI3K/Akt信号通路在MMC诱导的WB-F334细胞凋亡中的作用。结果显示，MMC组(33.74±5.57)%，SB组(34.06±5.49)%及API-2组(12.04±5.62)%的细胞凋亡率均显著高于control组(2.44±8.73)%，且差异具有统计学意义(均P<0.05)。此外，SB组与MMC组中细胞的凋亡率并无显著差异(P>0.05)，提示SB对MMC诱导的WB-F334细胞凋亡并没有明显的作用；而API-2组中的细胞凋亡率明显低于MMC组，提示API-2对MMC诱导的WB-F334细胞凋亡有明显的抑制作用(P<0.05)。

图3 p38 MAPK抑制剂和PI3K/Akt抑制剂对MAPK及PI3K/Akt信号通路的抑制作用Fig.3 Effect of p38 MAPK inhibitor and Akt inhibitor on MAPK and PI3K/Akt signaling pathway in WB-F334 cells

3 讨论

肝干细胞可被定向诱导分化成肝细胞和胆管细胞[4]，当肝细胞受到严重损害或受特定因素影响而造成肝脏组织再生时，可选择促使肝干细胞增殖、分化，实现对肝损伤的修复[5]。信号转导途径作为调控细胞发育和生长的关键性因素之一，可显著影响细胞增殖、分化及凋亡等机制。

PI3K属于机体细胞内重要磷脂酰肌醇激酶之一，结构包括1个催化亚基和1个调节亚基[6]。该蛋白酶可作为关键信号分子参与机体多种生理活动。Akt则为PI3K下游直接靶蛋白[7]，属于一种原癌基因c-Akt过表达产物。已有研究者将多种细胞因子与其受体相互结合、作用生成PI3K基因p85片段亚单位位点，其具有高亲和性，可刺激Akt活化而诱发细胞生命活动[8]。文献报道称，PI3K/Akt通路可调控多种细胞生理信息传导，参与机体内各细胞周期运转[9-10]，启动细胞凋亡机制，并激活细胞侵袭特性。在肝细胞再生的过程中，有许多细胞因子参与肝细胞的生长、凋亡调控。MAPK作为一类胞质内蛋白激酶，其家族成员包括细胞外调节蛋白激酶(ERK)、p38 MAPK和c-Jun氨基末端激酶(JNK)[11]，均可调节细胞增殖、分化或凋亡等。基于此，笔者认为可通过人工干预方式调控MAPK和PI3K/Akt通路，实现对肝干细胞生长、增殖及分化的定向诱导。

研究显示[12]，机体内多种细胞因子均可调控肝组织细胞增殖及凋亡，从而促使肝脏再生。MMC可由链霉菌提取，分子含有苯醌、乙酰亚胺基和氨甲酰等活性基团，并于DNA链形成交联从而实现对DNA及RNA转录的调控，可诱导肝细胞或肿瘤细胞凋亡。但既往研究中，关于MMC诱发肝干细胞凋亡及其在肝干细胞生长调控过程中具体作用文献较少。在本研究中，笔者通过选择不同浓度MMC对肝干细胞采取细胞毒干扰，结果显示，MMC作用6、12和24 h时的WB-F334细胞凋亡率均高于对照组，且随时间的增加而上升，而MMC对肝干细胞的细胞毒作用也随MMC浓度升高而上升，结果表明MMC可明显抑制肝干细胞增殖及促使肝干细胞凋亡。

在研究中，笔者进一步采取MMC刺激WB-F334细胞，结果显示MAPK，Akt均发生磷酸化，且磷酸化程度随着时间而减弱，这表明p38 MAPK和PI3K/Akt途径能够被MMC激活。在此基础上，笔者使用抑制剂API-2阻断PI3K/Akt和SB203580阻断p38 MAPK，结果显示API-2处理可以成功阻断Akt的磷酸化过程，而其对p38 MAPK的磷酸化并无影响；SB203580可以成功阻断p38 MAPK的磷酸化而并不影响Akt的磷酸化。我们发现MAPK途径阻断后，由MMC引起的肝干细胞凋亡率并没有受到明显抑制，而PI3K/Akt途径被阻断后则造成MMC诱导凋亡效应显著下降，这表明MMC诱导肝干细胞凋亡机制可能以PI3K/Akt途径介导为主，而p38 MAPK途径可能不参与MMC介导肝干细胞凋亡过程或参与程度较低。

综上所述，MMC能够刺激肝干细胞WB-F334发生凋亡，其诱导凋亡的作用是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的。当然，信号转导调节细胞生理功能作用机制较复杂，故仍需进一步研究加以完善。

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(2016-10-11 收稿)

Role of PI3K/Akt Pathway in MMC Induced Apoptosis of Liver Stem Cells

Liu Huijie1，Xu Dan2，Peng Rong3

1DepartmentofOncology,XiangyangCentralHospitalAffiliatedtoHubeiCollegeofArtsandScience，Xiangyang441021，China2DepartmentofGastroenterology，WuhanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Wuhan430014，China3DepartmentofOncology，YichengHospital，Yicheng441400，China

Objective To investigate the role of PI3K/Akt pathway in mitomycin(MMC) induced apoptosis of liver stem cells.Methods Rat liver stem cells were stimulated with MMC，and the effect of MMC on the apoptosis rate of WB-F334 cells at different time points(6，12，24 h)，as well as the effects of different concentrations of (0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL) MMC on the cytotoxicity of WB-F334 cells were evaluated；moreover，cells were treated with p38 MAPK inhibitor and PI3K/Akt inhibitor，and the roles of MAPK and PI3K/Akt signaling pathway in MMC mediated apoptosis of WB-F334 cells were explored.Results The apoptosis rate of the MMC-treated WB-F334 increased with time(P<0.05).Compared with the un-treated control group，different concentrations of MMC had obvious cytotoxicity on liver stem cells，and the cytotoxicity increased with concentration.Western blotting results showed that Akt and MAPK in WB-F334 cells were significantly phosphorylated 15 min after MMC stimulation；the degree of phosphorylation decreased with time，and phosphorylation disappeared after 60 min，suggesting that the p38 MAPK，PI3K/Akt pathway can be activated by MMC；furthermore，when p38 MAPK inhibitor was added to MMC treated cells，the apoptosis rate of p38 MAPK inhibitor treated cells showed no significant difference compared to the un-treated cells(P>0.05)，indicating that the MAPK pathway had no significant effect on MMC induced WB-F334 cell death；however，when the PI3K/Akt inhibitor(API-2)was added，the apoptosis rate of API-2 treated cells was significantly decreased compared to the un-treated cells(P<0.05)，indicating that the PI3K/Akt pathway had a significant effect on MMC induced apoptosis of WB-F334 cells(P<0.05).Conclusion Stimulation of MMC can induce apoptosis of hepatic stem cells WB-F334 through the activation of the PI3K/Akt signaling pathway.

hepatic stem cell； apoptosis； mitomycin； PI3K； Akt； signal pathway

*湖北省襄阳市2014年市级立项课题(No.20140915)

刘晖杰，女，1977年生，副主任医师，E-mail：xfhuahua@163.com

R322.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.015