退行性主动脉瓣脂肪因子chemerin的表达＊

谢 霆， 李儒正， 吴朝光， 张 红， 陈新忠

1海南省人民医院心脏外科，海口 570311

2华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管外科，武汉 430022

退行性主动脉瓣疾病（degenerative aortic valve disease，DAVD）是常见的成人瓣膜性心脏病，老年患者患病率最高，病变与动脉粥样硬化有一定的相似之处，损伤瓣膜组织可见脂质和炎症细胞蓄积，还可见新生血管和钙化灶［1］。随着对脂肪因子研究的深入，大量证据表明脂肪细胞因子参与了动脉粥样硬化的发生发展［2－3］，但脂肪因子在 DAVD中的作用研究资料较少。chemerin是2007年发现的脂肪因子，在脂肪细胞中chemerin基因表达丰度高，能调节脂肪细胞分化，调节脂质代谢和转运基因表达，还参与调节炎症和钙化［4－5］。因此，我们推测脂肪因子chemerin可能在DAVD中表达。

1 资料与方法

1．1 研究对象

收集2012年10月至2013年10月在海南省人民医院心脏外科因DAVD行手术切除的主动脉瓣标本30例，男17例，女13例，年龄（55±6）岁；夹层动脉瘤行Bentall手术切除正常主动脉瓣标本7例，男4例，女3例，年龄（41±8）岁。排除标准包括：排除先天性主动脉瓣畸形、风湿性心脏瓣膜病、感染性心内膜炎和马凡综合征，排除甲状旁腺疾病和肾功能衰竭等影响钙磷代谢，以及炎症指标C反应蛋白和血沉升高的患者。所有组织标本均根据《赫尔辛基宣言》经患者及家属知情同意后采集，研究方案获医院伦理委员会批准。

1．2 方法

1．2．1 主动脉瓣膜的取材 观察瓣膜标本后剪掉瓣膜基底部和尖部，选取瓣膜中部，一部分瓣膜用苏木精－伊红（HE）染色分析；一部分瓣膜用于免疫组织化学（IHC）染色分析。标本经10%中性甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、5μm连续切片。

1．2．2 标本HE染色 所有标本经我院病理科经验丰富的技师行常规HE染色，观察瓣膜的组织结构，包括瓣叶的厚度、炎症细胞和间质细胞、毛细血管和钙化。

1．2．3 IHC染色 兔抗人chemerin多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）按1∶100稀释，石蜡切片脱蜡水化，抗原修复后，采用PV－9000通用型二步法试剂盒操作，具体操作按试剂盒操作说明。

1．2．4 IHC染色图像分析 其中有8例标本因为钙化严重标本染色后无法观察到完整钙化灶和1例瓣膜未见到阳性表达而被排除，最后总共21例标本纳入图片分析。IPP（Image－Pro Plus）软件测量瓣膜钙化面积和钙化周围（钙周2mm区域）chemerin蛋 白 的 累 积 光 密 度 （integrated optical density，IOD），每个纳入IPP图片分析的标本，镜下随机选择5个高倍（×400）视野测量后选取平均值。

1．3 统计学方法

SPSS 19．0统计软件进行数据处理和分析，计数资料比较采用χ2检验；钙化面积和钙化周围chemerin表达的累积光密度相关性分析采用单元线性回归分析，以P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 瓣膜肉眼观察

正常的瓣叶呈半透明状，柔韧性好。DAVD表现为主动脉瓣口狭窄，瓣叶明显增厚、坚硬，钙化结节形成，累及瓣叶的基底部、中间部和瓣尖，钙化结节均主要位于主动脉侧，可见不同程度的脂肪组织。

2．2 HE染色结果

正常的瓣叶主要由5层构成，依次为：单层内皮细胞构成的主动脉侧内皮层、富含胶原纤维的胶原层、致密基质较少并排列疏松的松质层、有明显弹力纤维的心室层和单层内皮细胞构成的心室侧内皮层。正常瓣膜中无血管，无炎性细胞浸润（图1A）。DAVD瓣叶损伤内膜下可见胶原纤维增生、排列紊乱，可见泡沫细胞、脂肪细胞、炎症细胞、新生毛细血管和钙化灶（图1B、1C）。

2．3 脂肪因子chemerin IHC染色

正常瓣膜的7例标本未见chemerin阳性表达（图2A）；DAVD 瓣 膜 可 见，chemerin在29 例（96．7%）标本胞质和胞膜中阳性表达，免疫阳性反应产物为棕黄色颗粒（图2B、2C），1例（3．33%）chemerin阴性表达，正常瓣膜与DAVD瓣膜比较，差异有统计学意义（P＜0．05）。

2．4 IHC染色图像分析

IPP分析显示我们选择标本中chemerin蛋白的IOD值随着钙化结节的面积增加而增大，单元线性回归分析表明chemerin表达与钙化面积呈正相关（r＝0．985，P＜0．05）。见图3。

3 讨论

DAVD在老年人中较为常见，目前尚无有效的药物治疗方法可以防止或逆转DAVD，外科手术或经导管主动脉瓣置换术是唯一有效治疗本病的手段。瓣膜长期暴露在血流冲击和血液脂质等介质的接触下，正常组织结构容易遭受破坏，导致血脂积累，炎性细胞浸润，纤维增生，血管生成，最终瓣膜钙化。目前认为DAVD是主动钙化过程，涉及到极其复杂的过程，脂质被认为是促发因素［6］。在DAVD瓣膜标本可见脂肪组织在钙化灶周围，显微镜观察显示DAVD瓣膜标本钙化周围可见到富含脂质的泡沫细胞和脂肪细胞。

图1 瓣膜组织的苏木精－伊红染色图片Fig．1 HE staining of valve tissues

图2 瓣膜组织脂肪因子chemerin IHC染色Fig．2 IHC staining of chemerin in valves

图3 退行性主动脉瓣chemerin表达与钙化面积的相关性Fig．3 Relationship between the area of calcification and the expression of chemerin protein in degenerative aortic valves

传统观念认为脂肪组织是一种终末分化的能量贮备器官，仅仅起着贮存中性脂肪、供应能量、减震以及调节体温等作用，然而近20年来研究证实脂肪组织能够生成和分泌大量的细胞因子、生长因子和活性肽等（统称为脂肪因子），它们以旁分泌、自分泌和内分泌的方式作用于远隔或邻近器官组织，在能量代谢、免疫应答和炎症反应的调节中发挥重要作用。随着研究的深入，人们发现脂肪因子也参与钙化的发生发展。脂肪因子瘦素和肿瘤坏死因子α在体内外均可促进血管平滑肌细胞成骨样分化及钙化，而脂肪因子脂联素、网膜素则可抑制钙化，提示各脂肪因子可能在钙化过程中以协同或拮抗的方式发挥重要的调节功能，构成促钙化和抑钙化的复杂的调节网络［2］。目前脂肪因子与钙化的研究多聚焦于血管钙化，关于脂肪因子与瓣膜钙化的文献国内外未见报道，本文尝试研究脂肪因子在瓣膜钙化中的表达。

chemerin是2007年发现的脂肪因子，在脂肪细胞高度表达，经过金属蛋白酶、蛋白水解酶、凝血酶等多种酶分解后产生活性［7］，活性的chemerin能够调节脂肪细胞分化、脂肪代谢和转运基因表达［8－10］。chemerin 具 有 2 个 功 能 不 同 的 配 体，CMKLR1和CCRL2；其中CMKLR1在炎症细胞中表达丰度较高。CCRL2结合chemerin后增加局部chemerin浓度并呈递chemerin给附近表达CMKLR1的炎症细胞，进而促进炎症细胞迁移［4，11］，本次实验标本检测表明在DAVD瓣膜钙化周围的炎症细胞区域是chemerin阳性表达的区域，而正常瓣膜未见chemerin阳性表达，我们推测可能是DAVD由于脂质蓄积，导致间质细胞转化为脂肪细胞的同时表达chemerin，促进了血液中的炎症细胞向瓣膜迁移和蓄积，或者是血液中的chemerin伴随脂质蓄积在DAVD瓣膜中，导致炎症细胞向瓣膜迁移。最近的研究表明chemerin参与钙化，若用抗体中和chemerin能够阻断钙化过程中重要细胞因子NFATc1（活化T细胞核因子1）的活化［5］，这提示chemerin可能促进瓣膜钙化。

总之，我们首次发现脂肪因子在DAVD中表达，拓展了我们的认知，DAVD中chemerin表达明显增高，而正常瓣膜未见chemerin表达，根据以前的研究，初步推断chemerin可能促进瓣膜钙化，但具体的机制还需进一步的深入研究。

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