生物信息模拟及生物学效应结合研究盐酸小檗碱对乙酰胆碱酯酶的抑制作用＊

王 晨， 谭 政， 邹 欣， 刘慎沛， 王开富△

华中科技大学同济医学院附属同济医院 1药学部 3中西医结合研究所

4实验医学研究中心，武汉 430030

2华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系，武汉 430030

盐酸小檗碱是黄连生物碱中的有效成分之一，前期研究证明其可以抑制包括血清在内许多组织中乙酰胆碱酯酶（AchE）的活性［1－2］，有关 AchE 与炎症、胰岛素抵抗的关系越来越受到重视［3］。因此，本研究采用生物信息模拟技术，体外观察盐酸小檗碱与AchE分子对接效应，并对小鼠十二指肠组织及血清中AchE的活性进行了生物学检测，探讨盐酸小檗碱对小鼠十二指肠组织和血清中AchE活性的抑制作用。

1 材料与方法

1．1 药品和试剂

AchE测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），双缩脲总蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1．2 AchE的制备

SPF级昆明种小鼠80只，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，体重（20±2）g，动物合格证号：SCXK（鄂）2010－0009。行小鼠眼眶取血（分离血清备用）后断头处死，快速取出十二指肠，放入玻璃皿中，加入少量冰冷的磷酸缓冲液（PBS）漂洗，用干净的滤纸吸去十二指肠组织表面的水分和血液，称重后用眼科剪尽快剪碎组织块。将剪碎的组织倒入玻璃匀浆器中，再用少许冰冷的PBS冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰浴匀浆。然后再加入冷冻的PBS，按十二指肠组织重量与匀浆总体积1∶10的比例，稀释混匀。将制备好的10%十二指肠匀浆离心取上清待测。检测时将小鼠血清用PBS按1∶9稀释。

1．3 总蛋白含量的测定

用双缩脲法测得十二指肠组织匀浆总蛋白量为3．16g／L。

1．4 小鼠十二指肠匀浆和血清AchE活力测定

用改良Ellman比色法测定AchE的活力，按AchE测定试剂盒的方法测定。设标准管组、不加药测定管组、受试化合物（加盐酸小糪碱）测定管组，每组均设空白对照管和测定管，小鼠十二指肠组织匀浆液取样量为每管30μL。反应体系混匀，37℃准确反应6min，然后终止反应，混匀放置15min，在412nm波长测定各管吸光度（用PBS调零）。将受 试 药 盐 酸 小 檗 碱 配 成 0．007、0．015、0．03、0．0625、0．125、0．25、0．5、1．0mg／mL的无水乙醇溶液。按下列公式计算得AchE的活力。

小鼠十二指肠匀浆中AchE活力（U／mg）＝（A测定管－A对照管）／（A标准管－A空白管）×标准管浓度（1 μmol／mL）／蛋白量（mg／mL）。组织样品酶活力单位定义：每毫克组织蛋白样本在37℃保温6min，水解反应体系中1μmol基质为1个活力单位（U）。血清中 AchE 活力（U／mL）＝（A测定管－A对照管）／（A标准管－A空白管）×标准管浓度（1μmol／mL）×样品测试前稀释倍数。血清样品酶活力单位定义：每毫升血清样本在37℃保温6min，水解反应体系中1 μmol基质为1个活力单位（U）。抑制率计算方法抑制率＝（不加药组酶活力－加药组酶活力）／不加药组酶活力×100%。

1．5 5种生物碱与AchE体外分子对接实验

利用chemoffice获得盐酸小檗碱（Berberine）、巴马汀（Palmatine）和药根碱（Jatrorrhizine）、黄连碱（Coptisine）和表小檗碱（Epiberberine）的初始三维结构后，选用mm2力场进行能量最小化计算和分子动力学模拟，得优化后的结构文件，继而采用Accelrys Discovery studio中的receptor－ligand interactions CDOCKER模块进行分子对接。对接位点选用乙酰胆碱酯酶的 CAScatalytic anionic site（CAS）为对接位点，力场选用CHARMm，并赋予N原子一个正电荷。

1．6 统计学处理

2 结果

体外分子模拟结果显示：5种生物碱即盐酸小檗碱、药根碱、巴马汀碱、黄连碱及表小檗碱中只有盐酸小檗碱和药根碱能与AchE活性中心部位分子对接，结果见图1。体外生物学实验表明盐酸小檗碱能明显抑制小鼠肠组织中AchE活性，抑制程度与其浓度具有明显的量效关系，结果见表1。

图1 盐酸小糪碱和药根碱与AchE对接结果Fig．1 Docking results of berberine hydrochloride and jatrorrhizine to AchE

3 讨论

国外学者将毒扁豆碱和新斯的明（AchE抑制剂）应用于脓毒血症小鼠的治疗，显示2种抑制剂均可显著降低小鼠炎症因子水平，提高病鼠存活率，说明抑制胆碱酯酶能明显缓解机体的炎症反应［3］。近年有关炎症导致胰岛素抵抗（IR）的分子机制进展十分迅速，该学说认为胰岛素和受体结合后，将信号下传至效应器，炎症因子如 TNF－α、IL－1、IL－6等经由远分泌和旁分泌能严重干扰胰岛素敏感细胞内胰岛素信号下传，使糖脂代谢利用受阻，主要表现为：TNF－α、IL－1、IL－6等炎症因子通过激活IKKB，使IRS1 307位丝氨酸磷酸化，阻断胰岛素信号通路，同时通过激活NF－κB而上调炎症因子，进而诱发胰岛素抵抗［4－5］。

表1 盐酸小檗碱对小鼠肠组织、血清AchE的抑制作用（±s，n＝8）Table 1 Inhibiting effect of berberine on the activity of AchE in the duodenum and serum of mice（±s，n＝8）

表1 盐酸小檗碱对小鼠肠组织、血清AchE的抑制作用（±s，n＝8）Table 1 Inhibiting effect of berberine on the activity of AchE in the duodenum and serum of mice（±s，n＝8）

与不加药组比较，＊P＜0．05＊＊P＜0．01

盐酸小檗碱（mg／mL） 活力酶（U／mg） 抑制率（%） 血清活力酶（U／mL） 抑制率（%）肠组织不加药22．32±3．27 7．152±2．384 0．007 8．77±2．43＊＊ 60．70 6．840±2．004 4．36 0．015 8．52±1．39＊＊ 61．82 5．593±1．102＊ 21．79 0．030 7．15±2．14＊＊ 67．96 4．558±0．906＊＊ 36．26 0．062 6．79±2．00＊＊ 69．57 3．675±0．675＊＊ 48．62 0．125 5．95±2．73＊＊ 73．34 2．523±0．326＊＊ 64．72 0．250 4．89±3．21＊＊ 78．09 1．986±0．284＊＊ 72．23 0．500 4．07±1．89＊＊ 81．76 1．730±0．057＊＊ 75．58 1．000 3．14±2．13＊＊ 85．93 1．043±0．007＊＊85．40

新近 Tracey［6］提出的胆碱能抗炎通路（cholinergic anti－inflammatory pathway）：Ach－α7nAChRMAPK／JUK／START－NFκB，即指神经系统通过迷走神经能够显著、快速地抑制巨噬细胞肿瘤坏死因子－α（TNF－α）的释放，减轻全身性炎症反应，该通路由外周迷走神经及其释放的递质乙酰胆碱（Ach）为主构成，Ach与单核细胞上烟碱样α7受体或M受体结合后，通过细胞内信号传导途径显著抑制细胞产生 TNF－α、IL－1β、IL－6和IL－18促炎因子，调控炎症反应，由此可见，Ach在整个抗炎通路中的关键作用，AchE生理性底物为Ach，当其活性受到抑制时，Ach量增加或Ach作用时间延长。因此认为AchE与炎症及胰岛素抵抗之间存在密切关系。

黄连中含有5种分子结构十分相似的类似物即：盐酸小糪碱、药根碱、巴马汀碱、表小檗碱、黄连碱。有文献报道盐酸小檗碱体外可以抑制犬、马血清及兔脑匀浆中胆碱酯酶活性［1］，也有报道盐酸小檗碱对大鼠脑组织和血清中乙酰胆碱酯酶活性均有明显的抑制作用［2］。本研究进一步发现当盐酸小檗碱与小鼠十二指肠液共孵育后其胆碱酯酶的活性受到明显的抑制，其抑制程度与盐酸小檗碱所加的浓度存在明显的量效关系，表明盐酸小檗碱对肠道中的AchE也具有抑制作用。

有研究显示5种生物碱中仅有盐酸小糪碱和药根碱具有降糖作用且降糖效果盐酸小糪碱强于药根碱［7］，根据文献资料，本研究采用计算机分子模拟方法，利用 Accelrys Discovery studio中的receptorligand interactions CDOCKER 模 块 进 行 分 子 对接［8］。将5种生物碱作为配体分别与受体AchE进行体外分子对接，结果显示：只有盐酸小檗碱和药根碱可以与AchE活性中心对接，其他3个碱则完全对接不上，实验结果与上述报道十分吻合，表明盐酸小檗碱和药根碱发挥降糖作用很可能与抑制AchE活性有关，糖尿病属慢性炎症性疾病的学说受到广泛的重视和肯定，炎症因子导致糖尿病胰岛素抵抗［9］，因此认为AchE、炎症因子及胰岛素抵抗之间关系密切，降低或抑制AchE的活性是否是控制炎症和改善胰岛素抵抗的新靶点将有待进一步深入研究。

［1］ 沈映君．小檗碱体外可以抑制犬、马血清及兔脑匀浆中胆碱酯酶活性［M］／／沈映君．中药药理学．北京：人民卫生出版社，2000：208－221．

［2］ 张红，王开富，谭政．盐酸小檗碱对AchE抑制作用的实验研究［J］．内科急危重症杂志，2011，17（2）：110－111．

［3］ Hofer S，Eisenbach C，Lukic I K，et al．Pharmacologic cholinesterase inhibition improves survival in experimental sepsis［J］．Crit Care Med，2008，36（2）：404－408．

［4］ 周媛，刘保林，唐宁，等．胰岛素抵抗的炎症机制及治疗研究进展［J］．海峡药学，2008，20（4）：10－13．

［5］ Hirabara S M，Gorjão R，Vinolo M A，et al．Molecular targets related to inflammation and insulin resistance and potential interventions［J］．Biomed Biotechnol，2012，2012：1－16

［6］ Tracey K J．Physiology and immunology of the cholinergic anti－inflammatory pathway［J］．J Clin Invest，2007，117（2）：289－296．

［7］ 付燕，胡本容，汤强，等．药根碱、小檗碱、黄连煎剂及模拟方对小鼠血糖的影响［J］．中草药，2005，36（4）：548－551．

［8］ Zhao Y，Feng W，Yang Y，et al．The comparison of property of tumor necrosis factor－αconverting enzyme（TACE）and some matrix metalloproteases（MMPs）in catalytic domain［J］．J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2006，26（6）：637－639．

［9］ 姜腾，胡蜀红，杨雁，等．吡格列酮改善2型糖尿病大鼠脑内胰岛素抵抗以及阿尔茨海默病样tau蛋白磷酸化［J］．华中科技大学学报：医学版，2013，42（2）：137－142．