超声靶向转染缺氧诱导因子干扰基因治疗大鼠肝癌的研究＊

丁尚伟， 黄晓宇， 姚梦云， 张培歌， 武 彧， 于艾嘉， 吕 清， 张 丽， 张艳容

华中科技大学同济医学院附属协和医院超声影像科，武汉430022

肿瘤的生长与血管的新生密切相关，抑制肿瘤血管的生长可以使肿瘤缺氧坏死，有助于抑制肿瘤的生长。缺氧诱导因子－1α（HIF－1α）在缺氧的条件下可以诱导血管新生，改善组织的缺氧、缺血，因此阻断HIF－1α在缺氧条件下的表达可以实现肿瘤组织的持续缺血、缺氧，继而坏死，诱发凋亡［1］。超声靶向微泡破坏是导入外源性的干扰RNA常用方法之一［2－3］，具有安全、靶向的效果，在基因治疗领域中应用越来越广泛。本研究应用该技术将 HIF－1α shRNA转染至肝癌细胞内，干扰肿瘤的生长，以达到治疗肿瘤的目的。

1 材料与方法

1．1 主要试剂和仪器

大鼠乳腺癌细胞（Walker256细胞）由华中科技大学同济医学院细胞生物学系提供；HIF－1αshRNA质粒由华大基因公司提供；超声造影剂SonoVue（Bracco公司）；超声基因转染仪Sonitron 2000V（NEPA GENE公司）；10%水合氯醛。

1．2 肝癌种植瘤模型的构建

方法参照文献［4］，将 Walker256细胞（1．0×106个）注射于 Wistar大鼠（240～300g，购自湖北省疾病预防控制中心）颈部皮下，10d后取出颈部瘤组织，游离成约5mm3的小瘤块，将其种植于大鼠的肝左叶中部（距离肝下缘约1cm）。12d后超声造影检测成瘤效果并测量肿瘤大小。对肝癌3个径线均＜7mm或出现肝癌肝外转移的模型鼠予以剔除，肿瘤体积大小采用V（mm3）＝长×宽×高×π／6进行计算［5］。

1．3 超声靶向转染HIF－1αshRNA

无菌条件下开腹，暴露肝癌组织。根据大鼠体重将HIF－1αshRNA质粒与SonoVue按1μg／g∶4μL／g比例混合后，4℃条件下静置15min，然后经尾静脉匀速推注（0．5mL／min）。同时将超声探头置于肝癌组织表面，启动辐照，辐照参数为：1．5W／cm2、占空比20%、辐照时间6min、辐照频率1MHz。

1．4 分组及检测

将肝癌模型鼠随机分为假手术组和基因转染组（UTMD组），分别于治疗前、治疗后第3天、第7天、第14天进行超声造影检查，检测肿瘤大小及血供变化情况，治疗后每组各处死6只大鼠进行qPCR检测、Western blot检测、免疫组化及苏木精－伊红染色。麻醉剂量为10%水合氯醛3mL／kg。

1．5 数据统计处理

2 结果

2．1 一般情况

肝癌种植瘤建模成功率为86%。假手术组术中死亡率为1／20，死于麻醉意外；治疗后造影检查死亡率为1／19，死于麻醉意外。UTMD组术中死亡率为0／20，治疗后造影检查死亡率为2／20，死于麻醉意外。

2．2 超声造影检测肝癌大小

治疗后第3天两组肿瘤均有一定的增大，但UTMD组肿瘤增幅明显小于假手术组，两组肿瘤大小差异有统计学意义（P＜0．05）。治疗后第7天，假手术组肿瘤继续增大，UTMD组肿瘤大小保持稳定，两组间差异有统计学意义（P＜0．05）。治疗后第14天，假手术组肿瘤仍继续增大（图1），UTMD组肿瘤开始缩小（图2），两组间差异有统计学意义（P＜0．05）（表1）。

2．3 qPCR定量检测HIF－1αmRNA的表达和 Western blot检测HIF－1α蛋白表达

qPCR检测结果显示，UTMD组 HIF－1αmRNA的相对表达量在治疗后第3天就较假手术组明显降低，随着时间延长，HIF－1αmRNA一直处于低表达水平。与假手术组相比，两组之间差异均有统计学意义（均P＜0．05），见图3。

表1 两组大鼠不同时间点的肿瘤大小（mm3，±s）Table 1 Comparison of the tumor size at different time points between the two groups（mm3，±s）

表1 两组大鼠不同时间点的肿瘤大小（mm3，±s）Table 1 Comparison of the tumor size at different time points between the two groups（mm3，±s）

与相同时间点的假手术组比较，＊P＜0．05

组别 治疗前（n＝18） 治疗后第3天（n＝6） 治疗后第7天（n＝6） 治疗后第14天（n＝6）8．4±3 226．6 UTMD组 321．8±177．0 688．3±409．4＊ 729．6±487．9＊ 594．3±497．5假手术组 401．2±245．4 1 225．9±547．6 2 742．3±1 549．1 4 88＊

图1 假手术组治疗后第14天肝癌组织的超声造影Fig．1 Contrast－enhanced ultrasound imaging of hepatic tumor tissues in the sham operation group at 14days

图2 UTMD组治疗后第14天肝癌组织的超声造影Fig．2 Contrast－enhanced ultrasound imaging of hepatic tumor tissues in the UTMD treatment group at 14days

Western blot检测结果显示，与假手术组相比，UTMD组各时间点HIF－1α的蛋白表达量逐渐下调，治疗后第3天约为假手术组的（0．80±0．07），治疗后第7天约为假手术组的（0．54±0．09），治疗后第14天仅为假手术组的（0．24±0．07）。见图4。

图3 qPCR检测两组大鼠肝癌组织不同时间点HIF－1αmRNA的相对表达量Fig．3 The expression of HIF－1αmRNA in rat hepatic tumor tissues at different time points in two groups

图4 Western blot检测两组大鼠不同时间点HIF－1α蛋白的相对表达量Fig．4 Western blot analysis of the expression of HIF－1αprotein in rat hepatic tumor tissues at different time points in the two groups

2．4 肝癌组织的苏木精－伊红染色及免疫组织化学染色

治疗后第3天苏木精－伊红染色显示假手术组肿瘤细胞分布密集，体积较大，胞质丰富呈红染，核分裂像多见（图5A）；UTMD组肿瘤细胞分布较稀疏，体积较小，胞质淡染不丰富，核分裂像少见（图5B），且随着时间的延长，肿瘤细胞逐渐死亡，并由肝组织及纤维组织进行修复。

免疫组织化学染色显示肝癌组织细胞内HIF－1α蛋白的表达，假手术组在术后2周内，HIF－1α蛋白的表达一直较稳定（图6A）；UTMD组在第7天、14天HIF－1α蛋白表达明显下调，部分区域可见大片细胞死亡，细胞结构消失（图6B）。

图5 两组治疗后第3天肝癌组织的苏木精－伊红染色图（×400）Fig．5 HE staining of rat hepatic tumor tissues in the two groups 3days after treatment（×400）

图6 两组治疗后第14天HIF－1α蛋白免疫组织化学染色（×200）Fig．6 Immunohistochemical staining of the expression of HIF－1α protein in rat hepatic tumor tissues 14days after treatment（×200）

3 讨论

3．1 HIF－1α与肿瘤的生长

肿瘤在生长过程中，离不开新生血管的生成，而肝癌是一种强血管依赖性肿瘤，癌细胞内高表达的HIF－1α是促进新生血管形成、维持肿瘤继续生长、浸润和转移的重要因素［6］。由于肿瘤细胞生长旺盛，缺氧也就经常出现于肿瘤组织的生长过程中，肿瘤细胞在适应缺氧环境时，会通过HIF－1α来调节血管生长因子的表达，诱导新生血管的形成，从而改善组织缺氧，维持肿瘤的继续生长。

HIF－1最早是1992年在缺氧诱导的细胞核抽提物中发现的，由α和β两个亚基组成。HIF－1α在缺氧条件下，首先在细胞核内聚集，然后与HIF－1β结合形成异二聚体，成为有活性的HIF－1复合物，因此HIF－1α直接决定了 HIF－1的活性。HIF－1可以调节多种靶基因，均与氧或能量代谢有关，其中与肿瘤血管生长密切相关的是VEGF靶基因，与肿瘤细胞能量代谢有关的是糖酵解酶及糖转运子等。目前的研究表明，在缺氧条件下，调节VEGF的信号传导途径中，HIF－1是重要的主导因子，它不仅能稳定增加VEGF mRNA的表达，还能增强VEGF的转录及翻译能力。在缺氧条件下，HIF－1能增强糖酵解功能为肿瘤细胞提供能量，维持细胞活性，同时刺激VEGF的表达改善组织缺氧，而糖酵解的产物丙酮酸的聚集则抑制HIF－1α的有氧降解，与HIF－1α形成正反馈途径，以改善细胞缺氧和维持细胞存活。

虽然HIF－1能调控多种下游因子，共同维持肿瘤的生长和细胞活性，但新生血管的生长才是改善缺氧的根本途径，为肿瘤细胞带来氧气和营养物质，并使肿瘤沿着血管向周边浸润生长和转移。因此靶向针对血管生成的治疗方案是肿瘤治疗中的重要策略之一，具有抵抗肿瘤浸润、转移和复发的重要潜力。基因表达干扰［7］是基因治疗领域中近年兴起的新技术，主要是将小片段的基因序列（20bp左右）导入细胞内，然后特异性封闭靶基因的mRNA表达，降低其蛋白表达水平，使其对下游基因的调控失效。本研究中向肿瘤细胞内导入HIF－1α的干扰基因shRNA，从而调控肿瘤内血管的生长，达到抑制肿瘤生长的目的。体外研究证实，沉默HIF－1α能促进p27的表达和抑制Ki－67的表达，在一定程度上可以抑制肝癌细胞的增殖［8］。

3．2 缺氧／缺血与细胞凋亡

目前已有大量研究证实超声靶向基因转染技术能有效介导基因转染，具有安全、实用、靶向等优点，是基因治疗的未来发展方向之一［9］。超声介导HIF－1αshRNA基因转染至肿瘤细胞内后，可以看到HIF－1α的mRNA水平和蛋白水平均明显下调，证实 HIF－1αshRNA能沉默 HIF－1αmRNA。由于HIF－1α的减少，对肿瘤的生长也产生显著影响，在第1周肿瘤体积持续增大，表现为增殖大于死亡；第2周肿瘤体积才开始缩小，肿瘤细胞在分子生物学水平表现出明显的代谢减低，胞质不丰富，细胞核分裂像少见，细胞体积缩小等，并出现片状坏死区域，与非基因转染组具有显著区别，表现为增殖小于死亡。由于HIF－1αmRNA的沉默只会减少新生血管的形成，而不能直接杀死肿瘤细胞，因此在早期肿瘤仍然可以继续长大。但随着持续的缺氧，部分肿瘤细胞出现坏死，同时缺氧亦会诱发细胞凋亡。缺氧诱导细胞凋亡的主要机制有线粒体损伤、Ca2＋超载、自由基损伤、HIF－1、p53、Fas／Fas L等，多种因素共同参与细胞的凋亡过程［1］。

研究发现，缺氧能诱导心肌细胞内的半胱氨酸蛋白酶3（Caspase 3）的表达增高，流式细胞仪检测提示细胞凋亡率明显升高［10］。用十字孢碱诱导细胞凋亡，Caspase 3／7 的活 性 明显升 高，而抑制Caspase 3／7的活性则能显著降低细胞的凋亡［11］。在应用紫杉醇杀死肿瘤细胞时，缺氧条件下HIF－1α的高表达可以保护细胞，缺氧组的细胞凋亡率明显低于常氧组，从而产生耐药性［12］；由于 HIF－1α诱发凋亡的靶基因与放疗或化疗诱导凋亡的靶基因相同，因而沉默HIF－1α的表达可以降低肿瘤的耐药性［13］和提高放疗的敏感性［14］。此外，缺氧诱导自噬蛋白（beclin 1）的表达增加，可以使细胞在缺氧条件下能够降解自身物质获得生存的能量，逃逸凋亡，产生放疗抵抗；而抑制 HIF－1α的表达后，beclin 1蛋白表达降低，对放疗的敏感性明显提高［15］。但也有研究认为在长期的慢性缺氧条件中，HIF－1α参与诱导细胞凋亡的过程。缺氧时HIF－1α可以抑制p53的降解，使其表达增加，从而促进肿瘤细胞凋亡［16］。Nip3是Bcl－2凋亡家族的前凋亡成员，在它的启动子部分包含了一个HIF的反应元件，因此HIF－1可以激活Nip3的表达，从而启动Bcl－2诱导细胞凋亡的过程［17］。但也有研究发现［18］，低氧可以诱发人肝癌细胞株HepG2中的凋亡抑制蛋白2（IAP－2），抵抗缺氧所致的凋亡。

HIF－1αmRNA被沉默后，癌细胞处于低氧和低能量代谢水平，ATP显著减少，而缺氧所致的细胞凋亡，均首先表现为线粒体功能紊乱，尤其是线粒体跨膜电位的破坏。线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，一旦跨膜电位耗散，则细胞进入不可逆的凋亡过程。此外，其他因素如Ca2＋超载、氧自由基、毒性药物等均可导致线粒体损伤，甚至诱发最终的细胞凋亡程序。因此后期肿瘤体积的缩小可能既与肿瘤细胞缺氧坏死有关，也与肿瘤细胞缺氧诱发凋亡有关。本研究利用超声介导干扰RNA转染，沉默HIF－1αmRNA后发现肿瘤细胞大量死亡，随后表现出肿瘤体积缩小，可能与肿瘤细胞缺血缺氧导致坏死和凋亡有关。

3．3 超声靶向基因转染

单纯的超声辐照和单纯的微泡注射对提高基因转染效率无明显帮助，只有两者联合使用才能有效提高基因转染效率，达到治疗的目的。目前常用的超声转染方式主要是将基因与微泡混合后经静脉注入，然后利用超声辐照破坏特定区域内的微泡，实现靶向基因转染。但是由于超声束在体内具有较强的穿透能力，因此病灶周边的组织也会出现基因导入［19］。在前期的安全性评估研究中，我们发现在输出高能量的超声波进行转染时，对肿瘤后方的组织、肌层组织可以产生一定的损伤，因此该种靶向转染方式仍存在一定的缺陷，即对病灶周边的正常组织亦会导入外源性基因，甚至可能产生一定的损伤。靶向微泡是避免此种现象的重要武器，它可以特异性地聚集于病灶内；待周边组织的微泡消退后再行转染，则可避免基因转染对非病灶组织的影响，因此靶向微泡是超声介导基因治疗未来的重要发展方向。

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