血塞通注射液质量标准中生物活性测定的方法

时间：2024-07-29

王璐，刘勤，张红宇，刘永辉

（1）云南省食品药品监督检验研究院，云南昆明 650031；2）昆明医科大学第三附属医院，云南省肿瘤医院药学部，云南昆明 650118）

血塞通注射液是五加科植物三七的根茎经加工制成的三七总皂苷配制成的灭菌水溶液，是在心脑血管疾病治疗中发挥重要作用的中药注射剂，其功能主治为活血祛瘀，通脉活络[1-2]。用于中风偏瘫，淤血阻络证。血塞通注射液的的质量标准中规定三七总皂苷的含量应为其标示量的80.0%～120.0%，且规定了三七总皂苷的指纹图谱相似度不得低于0.95[3]，但中药的药材来源广泛、多变，制备工艺复杂，而且，中药中含有多种活性成分具有多种多样的药理作用，如果仅控制或检测评价少数成分，无法综合客观真实地反映药品安全、有效的相关质量问题。为保证每批药品的有效性和安全性，有必要丰富和完善中药的质量标准，在完成药品含量测定的基本要求外，有必要增加药品生物活性测定，选择原理明确的实验方法，选择检测指标应具备较强的客观性和专属性，应该能够充分体现药品的的功能主治或药理作用[4-5]。本研究中，笔者选取了工艺稳定、质量合格的3家企业6 个批号的血塞通注射液来进行小鼠体内血栓实验[6-7]、小鼠断头存活时间实验[6]、小鼠常压耐缺氧实验[8]、小鼠游泳时间实验（抗疲劳实验）[8]，最终筛选出实验方法应具备：简便、低廉、合理、明确、灵敏以及重现性好的生物活性测定的实验方法[9]。

1 材料和方法

1.1 材料

试药与动物1 号样品：规格2 mL:100 mg，批号20 160304；2 号样品：规格10 mL:250 mg 批号20160302 ；A 制药有限公司；3 号样品：规格5 mL:250 mg 批号ZKC1501；4 号样品：规格10 mL:400 mg 批号ZLE1501；B 制药有限公司5 号样品：规格5 mL:250 mg，批号15GK202-23；6 号样品：规格5 mL:250 mg，批号15GK201-12；C 制药有限公司。以上样品三七总皂苷含量测定均为标示量的80%～120%。血塞通注射液最大人用剂量6.67 mg/kg。

胶原蛋白型，酷尔生物，批号：B264565，规格1 g；盐酸肾上腺素注射液，上海和丰制药有限公司，批号10151101，规格1 mL:1 mg；注射用盐酸川芎嗪，合肥平光制药有限公司，批号201509073，规格80 mg；尼莫地平注射液，扬子江药业集团有限公司，批号16051541，规格20 mL:4 mg。

试验动物：小鼠，昆明医科大学实验动物学部提供，ICR，SPF 级别，雌雄兼有，体重18～20 g，动物生产许可证号：SCXK（滇） K2015-0002。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠体内血栓实验取18～20g 小鼠96 只（雌雄各半），按体重随机分为：阴性对照组、阳性对照组以及6 个批号的血塞通注射液组，共8组，每组12 只。给药途径为腹腔注射，给药体积0.2 mL/10 g，连续5d 给药，阴性对照组注射氯化钠注射液，阳性对照组注射60 mg/kg 的注射用盐酸川芎嗪（临床剂量30 倍），血塞通注射液组按体重200 mg/kg 的剂量（临床剂量30 倍）给药。在第5d 给药后30 min 进行尾静脉注射含肾上腺素0.02 mg/mL 与胶原蛋白0.60 mg/mL 的混合诱导剂造成小鼠血栓模型，给药体积0.1 mL/10 g，注射后立即观察小鼠死亡个数以及15 min 内小鼠偏瘫未恢复数，偏瘫率=（死亡个数+15 min 偏瘫未恢复个数）/总个数，保护率=（未偏瘫个数+15 min内偏瘫恢复个数）/总个数，阴性对照组的偏瘫率大于等于80%说明造模成功。

1.2.2 小鼠断头存活时间实验取小鼠96 只（18～20 g、雌雄各半），按体重随机分为阴性对照组、阳性对照组以及6 个批号的血塞通注射液组，共8 组，每组12 只，给药途径为腹腔注射，给药体积均为0.2 mL/10 g。阴性对照组给予氯化钠注射液，血塞通注射液组按200 mg/kg 的剂量（临床剂量30 倍）给药，连续5 d。阳性对照组给予1.65 mg/kg 的尼莫地平注射液（临床剂量25 倍），仅第5 天给药。于第5 天给药30 min 后，用大剪刀在小鼠耳下部位快速断头，记录小鼠断头后张口喘息停止时间。

1.2.3 小鼠常压耐缺氧实验取18～20g 小鼠96只（雌雄各半），按体重随机分为阴性对照组、阳性对照组以及6 个批号的血塞通注射液组，共8组，每组12 只，给药途径为腹腔注射，给药体积均为0.2 mL/10 g。阴性对照组给予氯化钠注射液，血塞通注射液组按200 mg/kg 的剂量（临床剂量30倍）给药，连续5 d。阳性对照组给予1.65 mg/kg的尼莫地平注射液（临床剂量25 倍），仅第5 d 给药。第5 d 给药30 min 后，将小鼠放入盛有15 g钠石灰的广口瓶内（每瓶放1 只小鼠），用凡士林涂抹瓶口并盖严，使之不漏气，开始计时，以呼吸停止为指标，观察小鼠因缺氧而死亡的时间。

1.2.4 小鼠游泳时间实验（抗疲劳实验）取小鼠96 只（雌雄各半，标准体重），按体重随机分为阴性对照组、阳性对照组以及6 个批号的血塞通注射液组，共8 组，每组12 只，给药途径为腹腔注射，给药体积均为0.2 mL/10 g。阴性对照组给予氯化钠注射液，血塞通注射液组按200 mg/kg 的剂量（临床剂量30 倍）给药，连续5d。阳性对照组给予1.65 mg/kg 的尼莫地平注射液（临床剂量25倍），仅第5 d 给药。在塑料大桶内加水，水深30 cm，水温保持在（27±0.5） ℃，各组动物均于第5 天给药30 min 后，在尾部束一负重物（负重物为8%体重），将小鼠分别放入塑料桶内游泳，开始计时，注意观察，当小鼠头部沉入水中10秒不能浮出水面者即为体力耗竭，即刻计时为小鼠游泳时间。

1.3 统计学处理

用SPSS 软件做统计分析进行统计。小鼠体内血栓实验以动物是否死亡计数，采用卡方检验进行统计。小鼠：断头存活时间实验、常压耐缺氧实验、游泳时间实验（抗疲劳实验）的结果均采用均数标准差（）表示，组间t检验，

2 结果

2.1 小鼠体内血栓实验结果

阳性对照组注射用盐酸川芎嗪及4 个批号的血塞通注射液与阴性对照组比较，未偏瘫个数与15min 内偏瘫恢复的数量增加，并且统计学具有显著性差异，表明所检测药品对混合诱导剂诱导的急性血栓有显著的保护作用。2 个批号的血塞通注射液与阴性对照组进行比较小鼠的未偏瘫个数和偏瘫后恢复个数增多，但统计结果差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 血塞通注射液对小鼠体内血栓的药效学实验结果比较［（），n=12］Tab.1 The effects of Xuesaitong injection on mouse thrombosis ［（），n=12］

与阴性组比较，#P＜0.05。

2.2 小鼠断头存活时间实验结果

阳性对照组尼莫地平注射液及5 个批号血塞通注射液与阴性对照组比较喘息的时间明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05），其中1 个批号的血塞通注射液与与阴性对照组比较喘息的时间明显延长，统计学结果差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 血塞通注射液小鼠断头存活时间实验结果比较［（），n=12］Tab.2 The effects of Xuesaitong injection on mouse decapitation survival experiment ［（），n=12］

与阴性组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.3 小鼠常压耐缺氧实验结果

阳性对照组尼莫地平注射液与阴性对照组比较喘息的时间有明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05）；4 个批号的血塞通注射液与与阴性对照组比较喘息的时间有明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05）；2 个批号的血塞通注射液与与阴性对照组比较喘息时间延长，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 血塞通注射液常压耐缺氧作用的药效学研究［（），n=12］Tab.3 The effects of Xuesaitong injection on atmospheric anoxia experiment ［（），n=12］

与阴性组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.4 小鼠游泳时间实验结果

阳性对照组尼莫地平注射液与阴性对照组进行比较游泳的时间有所延长，差异无统计学意义（P＞0.05）；3 个批号血塞通注射液与与阴性对照组比较游泳时间的明显延长，差异有统计学意义（P＜0.05）；3 个批号的血塞通注射液与与阴性对照组比较游泳的有时间延长，差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 血塞通注射液小鼠游泳时间实验（抗疲劳实验）的药效学实验结果比较［（），n=12］Tab.4 The effects of Xuesaitong injection on swimming time［（），n=12］

与阴性组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

3 讨论

3.1 在中药质量标准中增加生物活性测定项的必要性

本研究表明，虽然6 批血塞通注射液中三七总皂苷含量均符合目前质量标准规定，但生物活性测定结果有所不同，由于不同企业的生产工艺或同一企业不同的原料（产地）等因素的存在，导致血塞通注射液有效性存在明显的不同，目前，中药注射液存在活性成分不明，工艺可变因素多等许多问题，脱离了生物活性的成分的理化分析并不能全面地控制其质量和充分反映其临床疗效，结合“生物活性测定”方法进行药品的综合评价才能更好地反映其质量和疗效[10]。

3.2 分析结果和比较方法

本试验严格按照《中国药典》2015 年版四部附录“中药生物活性测定指导原则”[9]进行设计，建立的生物活性测定方法符合随机、对照、重复药理学研究的基本原则，选择的检测指标应客观、专属性强，与该品种的功能主治密切相关[11]。研究中，笔者选用了工艺稳定、质量合格且市场占有率较高的3 家企业生产的血塞通注射液共4 个规格6 个批号的样品，根据其主要药效学为活血化瘀抗缺氧耐疲劳，我们将生物活性测定方法集中在四个方法，即小鼠体内血栓实验、小鼠断头存活时间实验、小鼠常压耐缺氧实验、小鼠游泳时间实验（抗疲劳实验）反复筛选。

在四个药效学实验中，对各实验测定方法影响因素进行考察，其中小鼠断头存活的实验结果与临床有较大差异，而且，不同厂家的产品检测结果比较接近，敏感性较差，特别是在质量仅有微小差异的情况下更不适用。小鼠游泳时间实验（抗疲劳实验）方法简单易行，但是实验中小鼠游泳时水温对小鼠是非疲劳性刺激，水温不能保持恒定或者温度过高过低均会影响实验结果，另外动物本身个体差异也会导致游泳时间差别较大，本实验误差较大。小鼠体内血栓实验及小鼠常压耐缺氧实验受人为因素干扰较小且较敏感，实验周期短，指标明确，操作方法简单易行，平行性好，不需要复杂仪器。小鼠体内血栓实验以死亡与否为计数数据，采用χ2检验进行统计，统计方法简单成熟，小鼠常压耐缺氧实验统计采用组间t检验，方法简单，误差控制限值较低。另外“生物活性测定”如果要正式收载于质量标准中，还必须考虑一些实验条件应选择：背景资料清楚、影响因素少、成本低廉和检测指标灵敏度高的试验系统；应尽可能选择小鼠和大鼠等来源广成本低的实验动物，并且符合“3R”减少和替代的原则[10]。以本实验结果以及评价指标为基础，初步建立适宜于血塞通注射液生物活性的测定方法：小鼠体内血栓形成实验和小鼠常压耐缺氧实验。

3.3 建立生物活性检定方法

血塞通注射液在临床广泛用于冠心病心绞痛脑梗死等急重症病患，属于急重症用药，应该能保证每个批次的产品具有可靠的生物活性，因此，应当在血塞通注射液质量标准中增加“生物活性测定”更好地综合评价其质量。严格按照《中国药典》指导原则，生物活性测定建议采用：初试和复试结合评价测定结果。初步拟定标准为：实验一取小鼠96 只，体重18～20 g，每次实验随机分为阳性对照组、阴性对照组和血塞通注射液组，每组10 只，给药途径为腹腔注射，给药体积0.2 mL/10 g，连续注射5 d，阴性对照组注射氯化钠注射液，阳性对照组注射60 mg/kg 的注射用盐酸川芎嗪（临床剂量30 倍），血塞通注射液组按200 mg/kg 的剂量（临床剂量30 倍）给药。在第5 天给药30 min 后进行小鼠尾静脉注射含肾上腺素0.02 mg/mL 与胶原蛋白0.60 mg/mL 的混合诱导剂造成小鼠血栓模型，给药体积0.1 mL/10 g，注射后立即观察小鼠死亡个数以及15 min 内小鼠偏瘫未恢复数量，偏瘫率=（死亡个数+15 min 偏瘫未恢复个数）/总个数，保护率=（未偏瘫个数+15 min内偏瘫恢复个数）/总个数，阴性对照组的偏瘫率大于等于80%说明模型成功。对数据进行统计学组间t检验处理。结果判断：阳性对照组盐酸川芎嗪作用与阴性对照组进行比较，小鼠未偏瘫数与小鼠偏瘫恢复个数增多，并且统计学结果有显著性差异时，实验成立。给药组与阴性对照组比较，小鼠未偏瘫个数与小鼠偏瘫恢复数增多，统计学结果有显著性差异时应判为符合规定。如给药组与阴性对照组比较，统计结果没有显著性差异，应复试。复试时每组小鼠为15 只，其余条件同上，复试的统计学结果具有显著性差异，判定应为符合规定，否则为不符合规定。

实验二取体重18～20 g 小鼠96 只，每次实验随机分成阴性对照组、阳性对照组血塞通组，每组10 只，给药途径为腹腔注射，给药体积均为0.2 mL/10 g。阴性对照组给予氯化钠注射液，血塞通注射液组按200 mg/kg 的剂量（临床剂量30 倍）给药，连续5 d。阳性对照组给予1.65 mg/kg 的尼莫地平注射液（临床剂量25 倍），仅第5 d 给药。第5 天给药30 min 后，将小鼠放入盛有15 g 钠石灰的广口瓶内（每瓶放1 只小鼠），用凡士林涂抹瓶口盖严，使之不漏气，开始计时，以呼吸停止为指标，观察小鼠因缺氧而死亡的时间。结果判断：阳性对照组作用与阴性对照组比较，小鼠喘息时间明显延长，用组间t检验统计，当统计结果有显著性差异时，实验成立。给药组与阴性对照组进行比较，小鼠喘息的时间应明显延长，并且实验结果统计学具有显著性差异时判为符合规定。如给药组与阴性对照组比较，统计结果没有显著性差异，应复试。复试时每组小鼠数量为15 只，其余条件同上，复试的结果有统计学意义，判定为符合规定，否则为不符合规定。