七氟烷对人骨肉瘤Saos2 细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响

李珊珊，全宇航，龚玲俐，杨 会，浦劲宏，王忠慧

（昆明医科大学第三附属医院麻醉手术科，云南昆明 650118）

骨肉瘤（ostesarcoma，OS） 是青少年中第三常见的癌症，15 岁以下儿童的年发病率为5.6/100万[1]。微小残留疾病的存在，可导致大面积手术切除后癌症复发转移，是癌症患者死亡的首要原因。这些残留癌细胞的进展取决于围手术期多种协同的因素，其中包括麻醉技术及药物对肿瘤复发转移的影响。七氟烷对骨肉瘤的作用尚未阐明。笔者旨在探讨七氟烷对骨肉瘤Saos2 细胞的影响，以尽可能减少麻醉相关的肿瘤复发转移。

1 材料与方法

1.1 材料

人骨肉瘤细胞株（Saos2 细胞）：购自昆明江宗生物科技有限公司，由中国医学科学院医学生物学研究所分子生物室提供。胎牛血清：购自BIOSHARP 公司，RPMI1640 培养基、cck-8 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。七氟烷购自江苏恒瑞医药有限公司。划痕实验采用ibidi 伤口愈合与细胞迁移插件。

1.2 细胞培养方法与分组

向人骨肉瘤Saos2 细胞中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，置于37℃、5%CO2培养箱，取出处于对数期生长的Saos2 细胞，配制成1×106cell/mL 细胞悬液，接种于细胞培养板中，分别标记为对照组（Control 组）、1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组。将要处理的Saos2 细胞放置于特制无菌密闭容器中，密闭容器进气口与七氟烷麻醉机连接，出气口与气体分析仪连接；对照组以相同流量的无菌过滤氧气处理。每组处理相同时间各2 h，七氟烷处理完毕后，于密闭容器中取出细胞继续培养24 h，以供进行增殖、侵袭、迁移及凋亡能力的测定。

1.3 细胞增殖率检测

采用cck-8 法。0.25%胰酶消化收集细胞，接种至96 孔板内，每孔接种2500 个细胞，空白孔内只加入培养基和cck-8 溶液。过夜培养后按照实验分组做对应处理。处理结束后24 h 每孔加入10 μL cck-8 试剂，培养箱内孵育2 h 后酶标仪450nm 波长下检测吸光度（OD 值）。

1.4 细胞侵袭能力观察

采用Transwell 小室实验。在上下室之间铺上适宜浓度的基质胶。取对数期生长的Saos2 细胞，进行消化、离心配制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105cell/mL，每孔上室加入细胞悬液100 μL，下室加入500 μL 含FBS 培养液，接种后不同浓度七氟烷作用2 h 后培养箱内培养24 h。经固定、染色、清洗后100 倍镜下观察拍照。每个小室随机选取5 个视野，拍照并计数细胞数量。

1.5 划痕伤口愈合实验

0.25 %胰酶消化收集细胞，调整悬液浓度为2.5×104/mL，往ibidi 插件的左右孔中各加入100 μL 的细胞悬液。培养箱内培养至融合度达到90%～100%，小心的用镊子将伤口愈合插件拔出，用基础培养基清洗一次细胞，加入MEM 基础培养基，不同浓度七氟烷作用2 h 后培养箱内培养，于0 h、12 h 观察伤口愈合情况。采用ImageJ 图片分析软件计算划痕愈合率。

1.6 细胞凋亡实验

0.25 %胰酶消化收集细胞，接种至6 孔板内，每孔接种105个细胞。当细胞融合度达到70%左右时更换为MEM基础培养基，不同浓度七氟烷作用2 h，培养箱内培养24 h 后，用0.25 胰酶消化收集细胞，PBS 清洗两次。用100 μL 流式凋亡结合缓冲液重悬细胞，每管加入5 μL Annexin V 混匀，室温避光孵育10 min。随后每管加入5 μL PI 避光孵育5 min，用PBS 将液体补至1 mL 后流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 统计学处理

采用Graph pad8.0 统计软件处理数据。计量资料服从正态分布以均数±标准差描述，组间比较采用单因素方差分析，有差异用Dunnettt检验与对照组比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 cck-8 细胞增殖率检测结果

对照组和1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组的细胞增殖率分别为 100%、91.72%±2.23%、86.36% ±2.56%、81.97% ±3.71%，七氟烷组细胞增殖率均低于对照组（P＜0.05）），且随着七氟烷浓度的增加，抑制增殖作用增强，见图1。

2.2 Transwell 小室细胞侵袭能力的比较

对照组和1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组穿膜细胞数分别为（105.6±13.0）、（68.4±15.8）、（59.2±7.8）、（36.1±6.7）个。七氟烷组穿膜细胞数较对照组均减少（P＜0.05），表明随着浓度的增加，七氟烷抑制侵袭作用增强，见图2～3。

图1 各组Saos2 细胞增殖率的比较Fig.1 Comparison of the ratio proliferation of Saos2 cells among different groups

图2 各组Saos2 细胞侵袭能力的比较Fig.2 Comparison of the invasion of Saos2 cells among different groups

图3 各组Saos2 细胞侵袭能力的比较（×100）Fig.3 Comparison of the invasion of of Saos2 cells among different groups （×100）

2.3 划痕伤口愈合实验结果

对照组和1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组划痕愈合率分别为86.27%±4.56%、59.71% ±2.34%、56.10% ±2.81%、23.42% ±7.13%。七氟烷组划痕愈合率低于对照组，尤其以5.1%七氟烷组愈合率降低最为明显（P＜0.05），见图4、图5。

2.4 各组细胞凋亡结果比较

对照组和1.7%七氟烷组、3.4%七氟烷组、5.1%七氟烷组凋亡率分别为2.47% ± 0.56%、12.71% ±1.34%、17.50% ± 2.81%、25.42% ±3.13%。七氟烷组凋亡率均明显高于对照组，尤其以5.1%七氟烷组凋亡最为明显（P＜0.05）。见图6、图7。

3 讨论

图4 各组Saos2 细胞划痕伤口愈合率的比较Fig.4 Comparison of the ratio of wound healing of Saos2 cells among different groups

骨肉瘤（osteosarcoma，OS） 是骨组织最常见的原发性恶性肿瘤，恶性度高，青少年多发。目前骨肉瘤的治疗仍以新辅助化疗和手术治疗为主，5 a 生存率仍无明显提高。随着肿瘤学和麻醉学的研究进展，人们越来越关注麻醉药物及方式的选择对肿瘤患者预后的影响。吸入麻醉药七氟烷具有效能强、可控性好的特点，是目前临床常用的全身麻醉药。七氟烷除了全身麻醉作用外，还可以通过降低缺血再灌注损伤、减轻炎症反应，降低毛细血管通透性等起到多器官保护作用。研究显示[2]，吸入麻醉药物可以影响细胞的转录，也可以通过作用于多种受体、离子通道及神经递质发挥作用。

图5 各组Saos2 细胞划痕伤口愈合率的比较（×100）Fig.5 Comparison of the ratio of wound healing of Saos2 cells among different groups （×100）

图6 各组Saos2 细胞凋亡率比较Fig.6 Comparison of the ratio of apoptosis of Saos2 cells among different groups

图7 各组Saos2 细胞凋亡率比较Fig.7 Comparison of the ratio of apoptosis of Saos2 cells among different groups

越来越多的证据表明，七氟烷可以直接作用于肿瘤细胞，与肿瘤复发转移有关。其可能机制主要包括血小板活化、诱导凋亡小体产生以及Ras/ERK、TGF/smad3 和PI3K/AKT 等信号通路的激活等。以往的研宄显示，七氟烷可能通过降低XIAP、suvivin 基因的表达及激活caspase-3 基因而抑制肺癌A549 细胞增殖，诱导细胞凋亡[3]。七氟烷还能够抑制喉癌HEP-2 细胞和结肠癌sw620 细胞及HCT1116 细胞的增殖[4-6]。最新研究发现低浓度七氟烷可促进原发性犬乳腺癌细胞的增殖能力，但对于转移性的乳腺癌细胞表现为剂量浓度依赖性的抑制作用，认为与七氟烷调控NET1 基因有关[7]。但在乳腺癌的临床研究中七氟烷麻醉的患者并未表现出较差的预后[8]。七氟烷呈剂量依赖性的抑制慢性白血病干细胞/祖细胞的增殖能力，其机制是通过剂量依赖性的抑制Wnt/β-catenin 信通通路中b连环蛋白和c-myc 的表达[9]。另一研究表明七氟烷通过缺氧诱导因子促进脑胶质瘤干细胞在体外生长，可以增强卵巢癌和肾癌细胞的增殖能力[10]。最新研究表明吸入七氟醚可抑制卵清蛋白（OVA）诱导的小鼠慢性气道炎症，同时抑制气道增厚，抑制杯状细胞、平滑肌增生，抑制胶原沉积和纤维增生，从而减轻小鼠肺组织的气道重塑[11]。

大量研究表明，七氟烷对肿瘤细胞的作用有细胞属性，与七氟烷作用时间、浓度有关联的。七氟烷临床常用浓度为1%～5.1%。本研究结果显示，低中高不同浓度七氟烷组细胞增殖率、穿膜细胞数以及伤口愈合率均低于对照组，以5.1%七氟烷组降低最为明显，3.4%七氟烷组次之。表明不同浓度的七氟烷均能够抑制Saos2 细胞增殖，侵袭及迁移能力，且浓度越高，作用越明显。笔者在细胞凋亡实验中发现不同浓度七氟烷对骨肉瘤Saos2 细胞的作用表现为促进凋亡，且与浓度呈正相关。但毕竟是体外细胞实验与临床实际尚有很大的差距，七氟烷对骨肉瘤患者的影响以及术后长期预后、麻醉相关的肿瘤复发转移等作用仍需进一步的体内实验证实。