动态监测食管癌患者手术及化疗前后T淋巴细胞亚群及NK细胞水平变化的意义

张辅君 ，龚 容

（1）昆明医科大学第一附属医院老年胸外科；2）云南省检验医学重点实验室，云南省实验诊断研究所，昆明医科大学第一附属医院检验科，云南 昆明 650032）

近年来，随着食管癌的免疫治疗研究的逐步推进，免疫检查点抑制剂已被批准用于食管癌的二线或三线疗法，越来越多的患者开始接受化免联合或序贯治疗。但既往的多数研究认为化疗对机体免疫系统会产生抑制作用，其中以T淋巴细胞数量与功能的下降最为明显[1]，而在免疫治疗中起关键作用的程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）均与T淋巴细胞密切相关，是重要的抑制性表面标志物。国外多项研究表明[2-4]若肿瘤抗原特异性T淋巴细胞数量减少，作为直接的临床结果，则表现出患者对PD1/PDL-1途径免疫治疗的反应较差。因此动态监测患者的T淋巴细胞亚群及NK细胞水平指标，以了解患者的免疫状态对后续免疫治疗有重要意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2018年1月至2020年12月于昆明医科大学第一附属医院住院的食管癌手术+化疗治疗的患者，纳入标准：（1）入院前无手术、放疗、化疗、免疫治疗史；（2）术前经胃镜活检确诊为食管恶性肿瘤[5]；（3）术后均有明确的病理诊断及TNM分期。排除标准：（1）存在严重损害免疫功能的疾病如获得性免疫缺陷综合征、系统性红斑狼疮、慢性乙型病毒性肝炎等；（2）近期存在明确感染史；（3）近期使用过胸腺肽等免疫增强剂。最终入组39例，年龄42～70岁，其中男性37例，女性2例。病理组织类型分布：39例均为鳞癌，分化程度：低分化9例，中-低分化19例，中分化10例，中高分化1例。根据食管癌TNM分期（UICC/AJCC 2017第8版）[6]：Ⅱ期29例，Ⅲ期10例。

同时随机选取39例同期体检者作为正常对照组，年龄35～72岁，平均59岁，其中男性35例，女性4例，见表1。

表1 患者基本信息（n）Tab.1 Clinical and pathological characteristics of patients enrolled in the study（n）

1.2 临床资料处理流程

患者入院后行开胸手术切除食管病变+胃代食管吻合术+淋巴结清扫术，术后禁食7 d，予全肠外营养治疗。7 d后复查食道造影，1例出现食管吻合口瘘，造成化疗时间推迟4周，其余病例均按期（术后3～4周）接受化疗治疗。化疗方案选择：奥沙利铂+紫杉醇。

所有患者均在不同时间点：手术前（入院时）、手术后3 d、手术后7 d、化疗第一周期前（即术后第3～4周）、化疗后1周、化疗后3周空腹采集3～4 mL EDTA抗凝全血，用于检测外周血T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）及NK细胞绝对计数。

1.3 检测方法及试剂

外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞百分比应用流式细胞术进行分析。采用美国BD FACS Calibur流式细胞仪和配套的淋巴细胞亚群检测试剂盒（Multi TEST IMK Kit）由专业检验人员严格按照操作流程检测。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件分析数据，食管癌组术前与正常对照组之间的比较采用t检验分析；不同时间点T淋巴细胞亚群变化情况采用重复测量的方差分析，进一步多重比较采用LSD法，结果以Mean ±SD表示。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌组手术前与正常对照组T淋巴细胞亚群及NK细胞水平比较

食管癌组患者术前CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、NK细胞水平显著低于正常对照组（P＜ 0.05），而CD8+的水平高于正常对照组，见表2。

表2 食管癌组术前与对照组T细胞亚群及NK细胞水平的比较（）Tab.2 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells in healthy controls and in patients with esophageal cancer before surgery（）

表2 食管癌组术前与对照组T细胞亚群及NK细胞水平的比较（）Tab.2 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells in healthy controls and in patients with esophageal cancer before surgery（）

2.2 食管癌组术后T淋巴细胞亚群及NK细胞水平变化情况

术后第3天、第7天患者外周血T淋巴细胞各亚群及NK细胞水平均较术前明显下降（P＜0.05），且在术后第3天为最低值，随后逐渐升高，直至化疗第1周期前（即术后第3～4周）恢复至接近术前水平。CD4+/CD8+在患者手术前后直至化疗第1周期前均无明显变化，见表3、图1。

图1 食管癌组术前、术后T细胞亚群及NK细胞水平变化趋势图Fig.1 The trend of T lymphocyte subsets and the levels of NK cells before and after surgery

表3 食管癌组术前、术后T细胞亚群及NK细胞水平的变化（）Tab.3 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells before and after surgery（）

表3 食管癌组术前、术后T细胞亚群及NK细胞水平的变化（）Tab.3 The proportions of lymphocytes subsets and the levels of NK cells before and after surgery（）

与手术前比较，*P ＜ 0.05。

2.3 食管癌组化疗后T淋巴细胞亚群及NK细胞水平变化情况

与化疗前相比，食管癌组患者化疗后1周CD3+、CD4+及CD4+/CD8+升高，而CD8+比例下降，差异具统计学意义（P＜ 0.05）。化疗后3周各T淋巴细胞亚群比例与化疗前基本相同。化疗前后NK细胞水平虽表现出与CD3+、CD4+类似的变化趋势，但差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表4、图2。

表4 食管癌组化疗前后T细胞亚群水平的变化（）Tab.4 The proportions of T lymphocyte subsets and NK cells in patients with esophageal cancer before and after chemotherapy（）

表4 食管癌组化疗前后T细胞亚群水平的变化（）Tab.4 The proportions of T lymphocyte subsets and NK cells in patients with esophageal cancer before and after chemotherapy（）

与化疗前比较，#P ＜ 0.05。

图2 食管癌组化疗前后T细胞亚群及NK细胞水平变化趋势图Fig.2 The trend of T lymphocyte subsets and the levels of NK cells before and after chemotherapy

3 讨论

大量研究表明在抗肿瘤的免疫反应中以细胞免疫为主，T淋巴细胞和NK细胞在其中具有重要作用。当T淋巴细胞亚群数量、功能发生改变，CD4+、CD8+平衡被打破，机体免疫系统紊乱，识别和杀伤恶性细胞的能力降低，这可能是导致癌症发生的免疫机制之一。在本研究中，治疗前食管癌组外周血CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+、NK细胞显著低于对照组，说明食管癌患者的免疫功能受到抑制，清除肿瘤细胞的能力已较正常人群减弱。在其他研究者的实验中[7-8]还发现：肿瘤分期越晚，免疫功能受到抑制的程度也越严重，这使得监测T淋巴细胞亚群及NK细胞的数量，具有协助判断肿瘤分期、评估治疗效果的指导意义。

在国内外的大多数报道中[9-13]，手术对机体免疫状态的影响多是抑制性的，其原因包括术中失血、麻醉镇痛、手术创伤等等，其机制包括手术应激、T淋巴细胞坏死、免疫炎性反应等。在本研究中，虽然观察到术后CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞水平的显著下降，但手术前后CD4+/CD8+却没有明显变化，这说明食管癌手术后外周血淋巴细胞总数量的下降可能才是导致机体免疫功能降低的主要原因。另外，在本研究中，T淋巴细胞亚群和NK细胞水平在术后3 d开始恢复，3～4周才恢复至接近术前水平，与其他研究者在肺癌、乳腺癌患者中的研究相比，食管癌患者术后免疫功能的恢复时间较长（肺癌患者平均7 d，乳腺癌患者平均5 d）[13-14]，推测原因可能是食管癌手术时间长，创伤较大，术后长时间禁食所导致机体免疫功能恢复缓慢，所以尽量缩短术后禁食时间、加用免疫调节剂或许能够促进术后免疫功能的恢复。

在食管癌的综合治疗中，化疗一直是重要的组成部分。虽然化疗能够杀伤大量肿瘤细胞、减少肿瘤负荷，但同时也能够破坏机体免疫系统、骨髓等造血系统，抑制DC等免疫细胞的产生。这使得化疗与免疫治疗在联合使用时，其使用先后顺序、同步或序贯产生了争议。本研究观察到患者化疗后短时间内CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+升高，而CD8+比例下降，说明免疫状态有所改善，这可能是由于化疗杀伤肿瘤细胞后，缓解了由肿瘤细胞直接诱导的免疫抑制。在化疗后3周各T淋巴细胞亚群比例已恢复至接近化疗前水平，这可能支持化疗与T细胞依赖性免疫治疗在同步或序贯方案中有效结合的想法。

综上所述，食管癌患者的免疫功能在治疗前后及治疗后的不同时间段均会发生改变，但由于检测方法的区别、人种的差异、肿瘤类型的不同，导致国内外报道中T淋巴细胞亚群及NK细胞变化趋势的不一致，甚至得出相反的结果，因此针对患者个体进行T淋巴细胞亚群及NK细胞的连续动态监测显得尤为重要，相较单次检测不仅能够更加准确地反映患者所处的免疫状态，还为后续免疫治疗提供依据。

本研究不足之处：（1）血液中的CD4+、CD8+还包含有其他更小的亚群，各个亚群的功能及特征均不相同，仅上述抗原还不足以准确描述手术及化疗对淋巴细胞亚群的影响；（2）在39例患者中，10例接受了额外的放射治疗，可能导致T细胞亚群数量的改变，故仅选取了化疗一周期后数据，使得本研究结果不能完全反映长期化疗后的情况。但在Krijgsman等[15]的研究中，实体瘤患者在进行4～6个周期的化疗后，与治疗前相比，B细胞变化显著，而T和NK细胞计数无明显变化。这可能支持本研究仅选择化疗一周期后数据的方案设计；（3）由于条件有限，未能进行NK细胞活性测定，在Ogura[16]的研究中发现化疗药物对NK细胞的作用根据疾病类型和化学治疗强度而变化，NK细胞的数量与活性并不一定同步增加或减少。这使得仅检测NK细胞数量无法准确反映NK细胞的免疫状态。