永生化麝鼠香腺成纤维细胞的转录组学分析

竭 航，赵春容，谌颖莲，赵贵军，张承露，封孝兰，曾德军*

（1.重庆市药物种植研究所/特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室，重庆 408435；2.陆军军医大学，重庆 400038）

麝鼠（Ondatra zibethicus）又名青根貂，因其繁殖期成年雄性个体的香腺中的分泌物麝鼠香（Muskrat musk）含有类似麝香的特性和成分，为麝香最佳替代原料。麝鼠香中的主要成分包括环酮类（如麝香酮、降麝香酮）、烷类、酯类、醛类和有机酸类等[1-3]，其中麝香酮含量为2%左右。研究表明麝鼠香具有与天然麝香类似的药理作用[4]，能起到抗炎镇痛[5]、增强心脏功能和降低血液黏稠度[6]、改善心肌缺血和保护心脏缺血性损伤等作用[7-9]。我国对麝鼠的研究有十多年的时间，但养殖规模小、数量少，还属初级阶段。麝鼠在非繁殖季节的秋冬季节不分泌麝鼠香，每只成年雄性麝鼠每年只能产麝鼠香5～6 g，麝鼠香就显得尤为珍贵。因此亟待寻找提高麝鼠产香量的新途径，以满足市场的需求。

随着细胞工程学的发展，前人在麝鼠香腺细胞离体分泌麝鼠香方面做了初步尝试[10]。研究表明，体外细胞分泌的麝鼠香与自然分泌的麝鼠香均含有环酮类、烷类、酯类、醛类和有机酸类成分[3]。这表明采用细胞工程方法生产人工麝鼠香是可能的。我们已通过转染的方法获得了永生化的麝鼠香腺成纤维细胞（申报专利正在实审中，申请号：202110034354.8），解决了麝鼠香腺细胞在体外最多培养6代即发生凋亡的难题，鉴于生物体中各成分直接或间接由细胞转录调控，因此，探究永生化过程对麝鼠香腺成纤维细胞转录组的影响有重要作用。

本研究在获得了永生化麝鼠香腺成纤维细胞的基础上，拟采用RNA-seq方法对永生化前后细胞进行检测，为开展麝鼠香腺发育、泌香调控及香腺生物反应器等能促进麝鼠香增产的科学研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验动物

麝鼠来自重庆市药物种植研究所麝鼠养殖基地，在2020年8月麝鼠泌香盛期，挑选成年健康麝鼠（1.2岁，体重1.6 kg）。麝鼠经乙醚吸入麻醉，立刻无菌采集香腺，置含100 U/mL青链霉素的PBS中带回实验室备用。

1.2 样品采集

采用常规动物细胞培养法获得麝鼠香腺原代成纤维细胞，分别收集一部分原代细胞，置1 mL Trizol中用于提取总RNA，另一部分原代细胞通过改进的慢病毒转染法获得永生化的麝鼠成纤维细胞。同样的方法收集一部分永生化的麝鼠香腺成纤维细胞，分别置1 mL Trizol中用于提取总RNA。

1.3 总RNA提取及质量控制

采用Trizol法提取永生化及非永生化麝鼠细胞总RNA，然后用Agilent 2100 bioanalyzer对RNA的完整性进行检测。

1.4 文库构建与质检

首先通过Oligo（dT）磁珠富集带有polyA尾的mRNA，随后在 Fragmentation Buffer中用二价阳离子将得到的mRNA随机打断。以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物合成cDNA第二条链。用AMPure XP beads筛选370～420 bp的cDNA，进行PCR扩增获得文库。文库构建完成后，使用Qubit2.0 Fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5 ng/μL，随后使用Agilent 2100 bioanalyzer对文库的insert size进行检测，q-PCR对文库有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。

1.5 测序

将已质检的cDNA文库送样至北京诺禾致源生物科技有限公司进行二代测序，采用Illumina 2500PE测序平台进行高通量测序。

1.6 数据分析

1.6.1 RAW READS质量控制分析

为了保证数据分析的质量及可靠性，去除原始数据中带接头、含N和Qphred≤20碱基数占整个read长度的50%以上的低质量reads。同时，对clean data进行 Q20、Q30和 GC含量计算。

1.6.2 序列的组装及基因注释

由于目前尚无可参考的麝鼠全基因组序列，故本研究采用Trinity（v20140717）软件进行重头组装[11]。

1.6.3 基因注释

对Unigene结果进行基因功能注释，所涉及数据库包括Nr（NCBI官方的蛋白序列数据库）、Nt（NCBI官方的核酸序列数据库）、Pfam（最全面的蛋白结构域注释的分类系统）、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG和GO等数据库。

1.6.4 差异基因分析

使用DESeq2包（v1.20.0）进行两组的差异表达分析[12]。采用 GOseq（2.10.0）[13]和 KOBAS（v2.0.12）[14]软件对差异基因集进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。差异表达基因的PPI分析基于已知和预测蛋白质-蛋白质相互作用的STRING数据库。对于数据库中存在的物种，我们通过从数据库中提取目标基因列表来构建网络；否则，使用diamond（0.9.13）将目标基因序列与选择的参考蛋白序列进行比对，然后根据所选参考物种的已知相互作用建立网络。

2 结果与分析

2.1 细胞培养结果

经慢病毒转染后，经连续传20余代后，细胞生长迅速，形态与非永生化时一致（图1）。

图1 麝鼠香腺成纤维细胞永生化前后对比图Figure 1 Immortalized and normal muskrat scent gland fibroblasts

2.2 转录测序与基因组装

6样品序列净读序列保持一致，为6.64 G～7.24 G，碱基错误率为0.02%，Phred数值大于20和30的碱基占比为95%以上，GC含量为52.21%～54.96%，这表明测序质量可靠可进行下一步分析。

用Trinity软件对测序数据进行基因组装，通过序列比对汇聚选择同一基因中最长的一条转录本为Unigene，总共发现基因数目为62 152个。

2.3 基因功能注释

通过利用序列比对的方法，以NR、NT、KO、Swiss Prot、PFAM、GO和KOG数据库为参考对Unigene进行注释，总共有44 406个unigenes被注释到，其中置信度较高的Genbank蛋白数据库NR注释到21 262个，占比34.2%。

通过进一步对有注释的基因进行GO、KOG和KEGG富集分析结果显示，在GO富集结果中，基因主要聚集在基本的细胞代谢、细胞生物学调控、蛋白结合和酶催化等基因的细胞基础代谢活动；在KOG富集中，也包含细胞正常活动代谢的各类过程，其中以信号传导过程富集数量占比最多；同样在KEGG中，信号转导占比最高，同时含有细胞正常代谢活动的各种生物学通路。

2.4 差异表达基因分析

对永生化麝鼠细胞和原代麝鼠细胞表达差异基因（表达差异两倍以上且校正P值显著，）及富集通路进行分析，结果显示，永生化麝鼠细胞和原代麝鼠细胞表达差异的基因总共有8 690个，其中在永生化麝鼠细胞中表达上调的基因有3 414个，表达下调的基因有5 276个（如图2所示）。

图2 表达差异基因火山图Figure 2 Volcano plot of different expressional genes

2.5 差异表达基因功能预测

进一步对差异基因进行KEGG通路富集分析，结果显示在永生化麝鼠细胞中上调的基因主要富集于DNA复制、同源重组、错配修复、细胞周期和RNA代谢通路，下调基因主要富集于氧化磷酸化、帕金森病和阿尔茨海默病疾病通路中（图3）；表达差异基因富集的KEGG信号通路列于表1；表达差异基因GO富集通路前20列于表2，主要涉及趋化因子活动、固醇类和激素代谢途径。

图3 表达差异基因通路富集Figure 3 Differental expressional gene pathway enrichment

表1 表达差异基因KEGG通路富集情况Table 1 KEGG pathway enrichment of differential expressional genes

表2 表达差异基因GO通路富集情况Table 2 GO pathway enrichment of differential expressional genes

3 讨论与结论

麝香是享誉国内外的珍稀中药材，具有极高的药用价值[15]，麝鼠香的开发已成为麝香替代的重点[1-3]。研究表明，基因的表达与泌香阶段密切相关[16-17]，鉴于麝鼠泌香由香腺中的分泌细胞和成纤维细胞共同完成[18-19]，开展麝鼠香腺细胞转录组研究，找到相关差异表达基因对出尽麝鼠体外细胞培养泌香具有重要的理论支撑作用。

细胞永生化是指在体外培养过程中，由于自身基因变化或者外界理化生条件的刺激，避免了正常细胞的衰老死亡，可以无限分裂传代的过程[20]。研究表明，奶牛乳腺上皮细胞永生化后在mRNA水平和表达及蛋白分泌方面依然能够维持与原代细胞类似的功能[21]。但李嘉嘉[22]的发现小鼠脾脏原代网状成纤维细胞永生化后2 815个基因表达上调，3 099个基因表达下调。本研究中麝鼠原代香腺细胞永生化前后表达上调的基因有3 414个，下调的基因有5 276个，趋势与李嘉嘉[20]的结果类似，说明通过病毒感染的永生化对麝鼠原代细胞基因的影响较大。对本研究差异表达基因的KEGG预测结果表明，上调的基因主要富集于DNA复制、同源重组、错配修复、细胞周期和RNA代谢通路，与李嘉嘉[22]的结果类似。鉴于永生化后细胞在增殖传代方面与原代细胞差异较大，而KEGG功能预测结果上调的基因主要富集于细胞增殖及核酸代谢，这与细胞永生化过程相符。这暗示麝鼠成纤维细胞增殖等通路可能与细胞永生化有关，为开展永生化过程如何影响麝鼠香腺细胞泌香功能的研究提供重要参考。

综上，通过病毒感染的永生化对麝鼠原代细胞基因的影响较大，可为后续建立永生化香腺细胞体外泌香体系提供支撑。