2013—2014年南京市流感病毒H3N2亚型血凝素分子遗传特性分析

杜雪飞，葛以跃，祁贤

1. 南京市疾病预防控制中心，南京 210009； 2. 江苏省疾病预防控制中心，南京 210009

·论著·

2013—2014年南京市流感病毒H3N2亚型血凝素分子遗传特性分析

杜雪飞1，葛以跃2，祁贤2

1. 南京市疾病预防控制中心，南京 210009； 2. 江苏省疾病预防控制中心，南京 210009

2013—2014年南京市流感病原监测系统分离到31株流感病毒H3N2亚型毒株，通过提取病毒RNA，反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增血凝素(hemagglutinin，HA)基因片段，进行PCR产物纯化、测序并分析其遗传进化特征。结果显示，31株分离株与疫苗株A/Texas/50/2012之间的核苷酸和氨基酸进化距离分别为0.010 2和0.012 1，核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.9%～99.6%和97.2%～99.3%。遗传进化分析表明，分离株的HA基因分属不同的进化分支，3株2013年分离株属3B基因型，3株2014年分离株属3C.1基因型，2株2014年分离株属3C.2b基因型，其余23株属3C.3a基因型。与疫苗株相比，分离株的分子特征表现为发生N128A/T和P198S/A(去信号肽排列)氨基酸位点变异，均位于抗原决定簇B；分离株抗原决定簇上发生变异的位点共计24个；7株分离株出现126 NWT糖基化位点，3株分离株糖基化位点45NSS和144NNS消失。结果提示， 2013—2014年南京市流感病毒H3N2亚型的HA基因较疫苗株发生了较大变异，疫苗对病毒的预防效果需重新评估。

流感病毒H3N2亚型；血凝素；分子特征

自1968年以来，甲型H3N2亚型流感病毒一直是人类季节性流感的重要病原。在人群免疫压力下，抗原漂移成为H3N2亚型变异的主要方式，也是持续引起流行的主要动因[1]。甲型流感病毒抗原变异中，以血凝素(hemagglutinin，HA)基因最重要，分析HA基因序列可在分子水平了解甲型流感病毒的变异特点和规律。南京市2009—2013年流感监测结果显示，除2010年春季和2011年季节性H3N2流感呈低水平散发外，其他时段均有季节性H3N2流感流行[2]。本研究选取南京市2013—2014年不同地区、不同时间段的31株季节性流感病毒H3N2亚型(2013年15株、2014年16株)进行HA基因特性分析，旨在了解H3N2亚型的变异情况，为流感防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

甲型H3N2亚型流感病毒毒株来自南京市流感监测哨点医院。2013年1月—2014年12月采集流感病例咽拭子标本，流感样病例的纳入标准按中国疾病预防控制中心(Chinese Center for Disease Control and Prevention，CDC)国家流感中心公布的标准。

1.2 样本采集及病毒分离

收集流感样病例咽拭子标本，提取病毒RNA，采用荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)对流感病毒的型别进行鉴定。阳性标本经MDCK细胞培养扩增后，上清液置于-80 ℃保存。

1.3 病毒HA基因片段PCR扩增

提取病毒核酸，采用Invitrogen公司的反转录试剂盒将病毒RNA反转录为cDNA，采用自行设计的引物对HA全基因进行PCR扩增。PCR扩增体系：总体积为50 μL。扩增程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，循环35次；72 ℃延伸10 min。4 ℃ 保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测和鉴定，凝胶回收PCR产物并纯化，纯化产物经测序仪完成测序。

1.4 基因序列分析

测序结果用CExpress软件进行比对拼接，获得全长HA基因序列。从NCBI Influenza Virus Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/nph-select.cgi?go=database)中选取2013—2014年全球不同地区流感病毒H3N2参考毒株(特别是中国和亚洲分离株)的HA序列，包括世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐的2013—2014年疫苗毒株A/Texas/50/2012(H3N2)。

采用MEGA 5.2.1 软件对序列进行比对(Clustal W)，采用FastTree 软件的GTR+GAMMA模型构建系统进化树，并进行基因和氨基酸变异分析。利用在线软件NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)对HA基因编码的氨基酸序列进行糖基化位点预测。

2 结果

2.1 同源性分析

用MEGA软件计算分离毒株与疫苗株HA基因的核苷酸和氨基酸平均遗传距离，分别为0.010 2和0.012 1；与疫苗株核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.9%～99.6%和97.2%～99.3%。

2.2 HA基因系统进化树分析

对31株流感病毒H3N2分离株的HA基因构建核苷酸进化树(图1)。其中3株2013年分离株(A/Jiangsutinghu/1268/2013、A/Jiangsuchongchuan/1423/2013和A/Jiangsuchongchuan/12237/2013)属3B基因型，3株2014年分离株(A/Jiangsutinghu/1448/2014、A/Jiangsutinghu/1351/2014和A/Jiangsuqingpu/152/2014)属3C.1基因型，2株2014年分离株(A/Jiangsudanyang/159/2014和A/Jiangsuquanshan/1258/2014)属3C.2b基因型，其余23株属3C.3a基因型。3C.1基因型平均遗传距离包含WHO推荐疫苗株A/Texas/50/2012和3株2014年南京分离株，均有S45N、T48I、K62E、A198S、T212A和V223I氨基酸变异。在3C.1基因型毒株变异的基础上，23株3C.3基因型分离株(包括2013年的13株和2014年的10株)发生T128A和R142G氨基酸变异。与3C.1基因型相比，3B基因型缺少糖基化位点45NSS和144NSS； 两者HA基因核苷酸和氨基酸的平均遗传距离分别为0.027和0.032。3C.1与3C.3基因型毒株之间HA基因核苷酸和氨基酸的平均遗传距离分别为0.012和0.014。

注：图中标尺值0.005代表单位长度内核苷酸差异水平；●代表WHO推荐的疫苗株；▲表示南京分离株。

图1 2013—2014年南京市流感病毒H3N2亚型的HA基因系统进化树

Fig.1 Phylogenetic analysis of influenza A virus H3N2 subtype strains isolated from Nanjing city during 2013-2014

表1 2013—2014年南京市流感病毒H3N2亚型分离株的抗原位点变异分析

Tab.1 Antigenic variants of influenza A virus H3N2 subtype strains isolated from Nanjing city during 2013-2014

毒株名称抗原位点(以H3亚型HA1序列为编号标准)A138142144145150B128159194198C454850278279312D182214217E629194262A/Texas/50/12ARNNRNFLPNIEKSSVIIESYSJs/1690/13-G-S-A--S-------------Js/32/13-G-S-A--S------IT----Js/1544/13-G-S-A--S------------Js/1423/13--K--T--AST-N-N---K---Js/12237/13--K--T--AST-N-N---K---Js/1398/13-G-S-A--S------------Js/38/13-G-S-A--S------------Js/1239/13-G-S-A--S------------Js/113/13-G-S-A--S--------V---Js/1341/13-G-S-A--S------------Js/1189/13-G-S-A--S------------Js/11752/13-G-S-A--S------------Js/1268/13--K--T-PASTKNYN---K---Js/149/13-G-S-A--S-------------Js/119/13-G-S-A--S-------------Js/116/14-G-S-A--S-------------Js/1448/14-----T--S-------------Js/1408/14-G-S-A--S-------------Js/159/14---S-T--S-----------H-Js/12486/14SG-S-AS-S---------G---Js/1351/14SG-S-AS-S------------Js/11383/14SG-S-AS-S------------Js/11692/14SG-S-AS-S------------Js/1780/14SG-S-AS-S------------Js/1839/14-G-STA--S---------N-KJs/111/14-G-S-A--S------------Js/152/14---S-T--S------------Js/1484/14-G-S-A--S------------Js/1258/14---S-T--S----------H-Js/1165/14-G-S-A--S------------Js/1122/13-G-S-A--S------------

2.3 HA分子特征分析

31株H3N2南京分离株的裂解位点序列为PEKQTR↓G，与参考株比对未发生变异，属于低致病力流感病毒。HA蛋白发生41处位点变异(按去信号肽HA氨基酸序列排序)，其中31株均发生变异的位点为N128A/T和P198S/A，发生变异频率较高的位点有R142G、N145S。本研究分离株的41处氨基酸变异位点中，32处位于HA1区，9处位于HA2区，分别占78.05%与21.95%。季节性流感病毒H3N2 HA蛋白的5个抗原决定簇(包括A、B、C、D和E)均分布于HA头部重链HA1区[3]。抗原决定簇内的氨基酸替换可能引起HA蛋白发生抗原漂移。本研究中分离株抗原决定簇上发生变异的位点共计24个(位于抗原决定簇A者5个、B者4个、C者6个、D者5个、E者4个)(表1)。流感病毒HA蛋白与宿主细胞表面受体结合是感染发生的关键步骤，HA蛋白的受体结合特性是流感病毒宿主限制性的一个重要决定因素[4]。HA蛋白的受体结合部位呈口袋状，位于HA1分子的球区末端，98、153位氨基酸侧链构成其底部，183、190、194位氨基酸构成其后壁，左壁和前壁分别由225～228、130～137位氨基酸构成[5]。本研究中1株分离株发生L194P变异，5株发生N225D变异，1株发生N225S变异。

HA蛋白糖基化位点在稳定HA三维结构和诱导机体产生保护性抗体方面起一定作用，其增加或减少对病毒的生物学特性均有一定影响[6]。7株测序毒株与疫苗株相比发生了N128T变异，出现126 NWT糖基化位点。2013年3株分离株均发生N45S和N144K变异，导致糖基化位点45NSS和144NNS消失。

3 讨论

自1968年流感流行以来，H3N2亚型由于基因突变发生频率较高，一直是引起人群感染的主要型别。2013—2014年中国流感监测数据显示，季节性H3N2亚型流感病毒成为南方省份流感流行的优势毒株。本研究中2013—2014年南京分离株与疫苗株A/Victoria/361/2011 HA核苷酸、氨基酸的同源性小于国内其他地区的报道[7]，可能与病毒表面蛋白变异加快有关。

一般认为，具有流行病学意义的流感病毒变种要存在一定抗原差异，HA1蛋白上至少有4个以上氨基酸发生替换，这些氨基酸替换需涉及2～3个抗原决定簇。上述氨基酸的替代可导致病毒抗原漂移[3,8]。与疫苗株相比，除1株分离株氨基酸位点变异仅涉及抗原决定簇B外，其余分离株涉及的抗原决定簇分别为2～5个，满足流感病毒新的变种要求。突变频率较高的HA变异位点N128A、R142G、N145S和P198S在Wedde等[9]的研究中也被发现。有研究表明，HA基因的T128A突变与儿童高病死率相关[10]。本研究中24株发生N128A突变，7株发生N128T突变，应继续加强对HA基因抗原位点变异的监测。以疫苗株为参考，本研究通过分析HA1蛋白抗原位点的氨基酸变异情况，提示流行株的抗原性可能发生变化，但需通过抗原性实验来验证流行株是否发生了抗原漂移。

流感病毒HA蛋白的糖基化对其抗原性和受体结合能力均有重要影响，可促进病毒进化[11-12]。本研究中分离株HA的固定糖基化位点共10个，另外出现3个位点改变。HA的氨基酸变异未涉及糖基化位点、抗原决定簇和受体结合位点者16个，其作用目前还不清楚[13]。

通过初步分析，本研究获得了南京市2013—2014年季节性H3N2亚型流感病毒的HA蛋白分子特征，其抗原位点、受体结合位点和糖基化位点的改变在一定程度上驱使其成为2013—2014年的优势毒株。

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. QI Xian, E-mail: qixiansyc@hotmail.com

Molecular characteristics of hemagglutinin of influenza A virus H3N2 subtype, 2013-2014, Nanjing

DU Xuefei1, GE Yiyue2, QI Xian2

1.NanjingCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China；2.JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China

A total of 31 representative strains of influenza A virus H3N2 subtype isolated at different time and regions in Nanjing between 2013 and 2014 through influenza pathogen monitoring system were selected for this study. The genetic distance between the vaccine strain A/Texas/50/2012 and the isolated group at nucleotide and amino acid levels were 0.010 2 and 0.012 1, respectively. The similarities of nucleotide and amino acid sequence were 97.9%-99.6% and 97.2%-99.3%, respectively. The phylogenetic analysis showed that hemagglutinin (HA) gene of 31 isolates could be divided into several groups. Three 2013 strains belonged to 3B, three 2014 strains belonged to 3C.1, two 2014 strains belonged to 3C.2b and the other 23 strains belonged to 3C.3a. Compared with the vaccine strain, the accumulated mutations on epitopes reached 24. The amino acid substitutions of N128A/T and P198S/A on HA in 31 isolates were observed. A new glycosylation site 126 NWT occurred in 7 isolates, and 45NSS and 144NNS glycosylation sites disappeared in 3 isolates. The results suggest that HA gene of H3N2 has a significant variation compared to the vaccine strain, and this may be related to the vaccine prevention program in Jiangsu Province during 2013-2014.

Influenza A virus H3N2 subtype; Hemagglutinin; Molecular characteristic

国家自然科学基金(81501785)，江苏省自然科学基金(BK20131450)，南京市医学科技发展专项资金(YKK10129)

祁贤

2016-08-23)