丹参酮IIA通过改善线粒体功能和氧化应激减轻大鼠认知障碍

李 洁，毛 宇，蒋可欣，马 磊，王 蕊

（华东理工大学药学院，上海市新药设计重点实验室，上海200237）

目前，血管性痴呆已成为继阿尔茨海默病之后第二大常见的痴呆类型[1-2]，并且有40%的病例被诊断为阿尔茨海默病混合型，表明在大多数患者中血管因素发挥了重要作用[3]。慢性脑灌注不足（CCH）是血管性痴呆发病机理中最常见的原因之一。CCH引起的脑能量代谢紊乱和氧化应激被认为是发病机理中的关键危险因素[4-5]。在缺血性疾病中，血流量减少将导致氧气和葡萄糖输送不足以及三磷酸腺苷（ATP）的产生和消耗之间的不平衡[6]。目前，已经证明氧化应激可以产生活性氧（ROS）的恶性循环，会进一步抑制正常的电子传递，最终导致代谢失衡[7]。双侧颈总动脉结扎（BCCAO）诱发的CCH 被广泛用作血管性痴呆的模型[8]。

丹参酮IIA（TSA）是从中药丹参中分离出来的活性化合物，具有保护心脏[9]、抗炎[10]、抗氧化和抗凋亡作用[11]，已被广泛用作预防或治疗心脑血管疾病[12-13]的有效药物。据报道，TSA 可减少大脑中动脉闭塞（MCAO）的梗塞体积并改善神经功能缺陷[14-15]。星形胶质细胞是大脑中最丰富的细胞，其和神经元之间双向信号的存在也揭示了星形胶质细胞在神经系统中的重要作用[16]。星形胶质细胞为神经元提供结构和代谢支持，保护血脑屏障，提供抗氧化防御作用[17-18]。然而，在氧化应激中，TSA 对星形胶质细胞的作用仍然未知。本文通过BCCAO动物模型、原代星形胶质细胞的氧化损伤模型探究TSA 的神经保护作用和机制。

1 实验部分

1.1 试剂和药物

2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购自Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；胶质纤维酸蛋白（GFAP）购自EnCor 生物技术公司；Nissl 染色试剂盒，荧光二抗IgG，Hoechst33242，CCK-8检测试剂盒，乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性试剂盒，ATP检测试剂盒，JC-1线粒体膜电位检测试剂盒和超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒均购自南京建成生物公司；BDNF抗体和复合物I酶活性检测试剂盒均购自Abcam 公司；二抗IgG 购自Santa Cruz 生物技术公司；化学发光试剂（ECL）试剂盒购自Thermo Scientific科技（中国）有限公司；细胞色素氧化酶活性测定试剂盒购自BioVision公司；免疫组化中脑源性神经营养因子（BDNF）抗体，生物素标记的羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素均购自北京博奥森生物技术有限公司。

多奈哌齐购自上海源叶生物科技有限公司。TSA（图1）由华东理工大学药学院的马磊课题组提供。

图1 TSA 的化学结构式Fig.1 Chemical structureof TSA

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与模型建立SD大鼠（雄性，8周，200～220 g）购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。将大鼠随机分为4组：BCCAO组，BCCAO+TSA组（15 mg/kg），BCCAO+多奈哌齐组（1 mg/kg）和假手术组（Sham)。药物预给药2周后，根据先前报道的实验方法进行BCCAO手术[19]，术后连续4周对大鼠进行灌胃给药，随后进行水迷宫（MWM）测试。

1.2.2 MWM 测试 通过MWM 测试大鼠的空间学习和记忆能力[20]。MWM 系统（AniLab Software&Instruments）包括一个充满水的圆形水池，直径为150 cm，深度为50 cm，分为4个象限并带有视觉提示。第1天为适应训练，装置中放置一个可见的平台（直径10 cm）来测试大鼠的视觉和运动能力。在第2～5天，将平台下降到水面以下，每天进行两次定位航行训练。在测试阶段，平台被移走，将每只大鼠依次从与目标象限相反的方向放入装置，由视频分析系统记录大鼠在目标象限停留的时间和运动轨迹。

1.2.3 尼氏染色 大鼠麻醉后，依次经心脏灌注生理盐水和0.04 g/mL 的多聚甲醛（PFA），将大脑储存在PFA 中。将梯度脱水、石蜡包埋的大脑组织制作成石蜡切片（厚5μm）。将切片脱蜡后滴加尼氏染色液染色10 min，酒精梯度脱水后浸入二甲苯中使透明，最后用中性树脂封片。使用Image J 软件对Nissl 染色阳性细胞进行计数。

1.2.4 Western blot 实验 将蛋白酶抑制剂和1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)在使用前分别加入裂解缓冲液，并在冰上裂解组织。将组织蛋白（上样量为30 μg）通过12%（质量分数）的分离胶分离，并转膜到孔径0.45μm的聚偏氟乙烯（PVDF）上。用0.05 g/mL的脱脂牛奶封闭2 h 后，将目标条带依次与BDNF抗体（BDNF抗体与稀释液体积比1∶1 000）孵育过夜，室温下与二抗IgG孵育2 h。通过ECL 发光液检测显色条带，使用化学发光成像仪（Tanon 5200s）曝光并用Image J 软件对条带进行定量。

1.2.5 免疫组化 石蜡切片脱蜡水化后置于柠檬酸缓冲液中，微波高火15 min 进行抗原热修复，自然冷却至室温。采用质量分数为3%的H2O2封闭内源性过氧化物酶，体积分数10%的山羊血清封闭非特异性结合，加入BDNF一抗（BDNF抗体与稀释液体积比1∶200）于4℃孵育过夜。滴加生物素标记的羊抗兔IgG 二抗于37℃孵育30 min，滴加HRP标记的链霉亲和素于37℃孵育30 min。滴加二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染2 min 后流水冲洗10 min返蓝。将切片经脱水、透明后封片，于显微镜（日本Nikon）下观察。

1.2.6 细胞培养 按文献方法制备原代大鼠星形胶质细胞[21]。简言之，通过断头使新生大鼠快速安乐死，并在冰上分离大脑皮层，去除脑膜后，将组织机械分散并过筛75μm 细胞筛以制成单细胞悬液，取200 g离心5 min 收集细胞，将细胞以2×106个 / mL 的密度接种在25 cm2的培养瓶中，并在37℃和5%（体积分数）CO2培养箱中培养8～9 d，将混合的细胞在摇床（Labwit Scientific）中以200 r/min 的转速在37℃摇动24 h 以除去附着在顶部的小胶质细胞和少突胶质细胞，通过免疫荧光鉴定获得星形胶质细胞纯度。首先，将细胞接种在经过聚L-赖氨酸预处理的盖玻片上，待细胞贴壁后，用0.04 g/mL 的PFA 在室温下固定15 min。将细胞用牛血清白蛋白（BSA，0.05 g/mL）封闭1 h 后与GFAP抗体（GFAP抗体与稀释液体积比1∶1000）在4℃孵育过夜。用PBS冲洗细胞3次，在室温下与荧光二抗IgG（IgG 与稀释液体积比1∶500）孵育2 h。将细胞与Hoechst33242（1μg/mL）孵育15 min。最后，将细胞漂洗3次，并在倒置荧光显微镜（日本Nikon）下观察。

1.2.7 H2O2诱导的细胞损伤和细胞活力检测 星形胶质细胞以1×105个/mL 接种于96孔板中培养24 h，TSA（0.001、0.01、0.1、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L）处理细胞24 h 后使用CCK-8检测细胞活力。在H2O2诱导的细胞损伤实验中，星形胶质细胞用TSA（0.001、0.01、0.1、1.0、2.5、5.0 μmol/L）预处理2 h 后加入H2O2（100 μmol/L）反应24 h，每孔中加入10 μL CCK-8，并在37℃下继续培养4 h。根据Synergy 2多功能酶标仪（BioTek）测得的450 nm 波长处的吸光度测试细胞活力。乳酸在LDH 的作用下转化为丙酮酸，伴随着辅酶I（NAD+）还原为还原型辅酶I（NADH），NADH 可以与碘硝基氯化四氮唑蓝（INT）反应形成甲臜，从而在490 nm 波长处产生吸收峰。收集每组的上清液并在25℃下与工作溶液反应30 min。实验前将细胞与裂解液孵育60 min，以测定LDH 的总释放量。各组释放量RLDH=（ODsample−ODblank）/ （ODTotal−ODblank）。

1.2.8 线粒体膜电位（MMP） 通过MMP检测试剂盒（JC-1）检测MMP。纯化的星形胶质细胞在加入H2O2之前用TSA 预处理2 h，细胞与染色工作液在37℃下孵育20 min。用染色缓冲液洗涤两次后，使用酶标仪（Perkin Elmer Enspire 2300）在525 nm（激发光）/590 nm（发射光）和490 nm（激发光）/530 nm（发射光）设置下分别检测聚合物与单体的荧光比值。

1.2.9 ATP水平 使用ATP分析试剂盒分别检测星形胶质细胞、皮层和海马中的ATP 水平。收集细胞或组织于冰上裂解，将样品在4℃、12 000 r/min 条件下离心10 min 以获得上清液用于进一步测定。按照说明书要求，将检测溶液添加到96孔板中并在室温下孵育5 min。将10μL 上清液与100μL 检测溶液快速混合，并通过BioTek 酶标仪测试化学发光。

1.2.1 0线粒体复合物ETC的复合物I（即NADH

脱氢酶）的活性通过复合物I酶活性检测试剂盒进行测试。在动力学测定中，将线粒体制备物添加到预先包被的微孔板中，微孔板中包含捕获复合物I 的特异性抗体。复合物I 的活性是通过NADH氧化为NAD+，同时染料被还原，从而导致450 nm 处的吸光度增加而确定。按照细胞色素氧化酶活性测定试剂盒评估复合物IV 的活性。在室温下制备细胞色素c的工作液，与待测样本混合，还原性细胞色素c因氧化导致550 nm 处吸光度降低，进而测定酶的活性。

1.2.1 1 ROS水平 根据先前描述的方法[22]使用DCFH-DA 评估ROS。DCFH-DA 可以自由通过细胞膜，并且容易水解为非荧光2',7'-二氯二氢荧光素（DCFH），后者可以被ROS进一步氧化生成荧光2',7'-二氯荧光素（DCF）。分别用终浓度为0、0.1、1.0、2.5、5.0 μmol/L的TSA 处理纯化的星形胶质细胞2 h。细胞与DCFHDA（10μmol/L）和Hoechst33242（1μg/mL）在37℃下共孵育20 min 后，PBS漂洗细胞3次，加入100 μmol/L H2O2作用30 min 并通过荧光显微镜观察荧光强度。

1.2.1 2 GSH、MDA、SOD的测定 将星形胶质细胞在6孔板中培养24 h，然后用TSA（0.1、1.0、2.5、5.0 μmol/L）预处理2 h，加入100 μmol/L H2O2作用24 h，收集细胞使之在冰上裂解，然后按照说明书的要求测定GSH、SOD、MDA 水平，将结果通过蛋白含量标准化。

1.2.1 3数据分析 数据表示为平均值±标准误差。在MWM中，通过双因素方差分析大鼠的逃避潜伏期。其他数据使用单因素方差分析，使用SPSS Statistics 22.0.0.0进行组间的差异性比较。n为每组样本数，P<0.05被认为有显著性差异，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001。

2 结果与讨论

2.1 TSA 改善了BCCAO引起的认知障碍

用MWM评估TSA 对BCCAO大鼠认知功能的影响。在定位航行训练中，BCCAO大鼠比假手术组大鼠花费更多的时间来寻找平台（训练第2天，P<0.01；第3天，P<0.05）。如图2（a）所示，TSA 和多奈哌齐（作为阳性对照）处理的BCCAO大鼠的逃避潜伏期短于未处理的BCCAO大鼠。如图2（b）所示，在测试阶段，BCCAO大鼠在目标象限的时间明显减少，TSA 处理延长了BCCAO大鼠在平台象限的停留时间。多奈哌齐也减轻了BCCAO引起的认知能力下降，但在测试剂量下未达到统计学差异。同时，图2（c）排除了平均游泳速度对实验结果的影响，各组大鼠代表性的游泳路径如图2（d）所示。

2.2 TSA 提高BCCAO大鼠海马神经元的存活

海马主要负责工作记忆和定向导航的部位[23]。通过尼氏染色对大鼠的海马进行形态学分析，分别对海马的CA1、CA3和齿状回（DG）区域中神经元存活细胞计数。如图3（b）和图3（c）中，BCCAO大鼠与假手术组大鼠相比，CA1和CA3区域中的神经元明显减少，而通过TSA 的治疗可以明显逆转神经元的丢失。如图3（d）所示，在DG 区神经元存活细胞数没有显著差异。

2.3 TSA 提高了BDNF 表达水平

据报道，BDNF可促进中枢神经系统神经元的存活[24]。通过Western Blot 检测各组皮层和海马中BDNF的表达水平，图4（a）和图4（b）分别为其定量结果。与假手术组相比，BCCAO损伤降低了皮层和海马中的BDNF水平，这与认知缺陷的结果是一致的。与未处理BCCAO大鼠相比，TSA 处理组大鼠的皮层和海马中BDNF的水平显著升高（P<0.05）。BDNF免疫组化结果显示，各组均可见棕黄色阳性细胞，但BCCAO大鼠的阳性染色细胞数减少，因此TSA 和多奈哌齐对损伤具有保护作用。

图2 （a）隐藏平台试验中的大鼠逃避潜伏期；（b）测试阶段大鼠在目标象限的停留时间；（c）平均游泳速度；（d）测试阶段代表性的游泳轨迹图（n=17）Fig.2(a)Escape latency of rats in hidden platform trials;(b)Time spent in the target quadrant in probe test;(c)Average swimming speed;(d)Representativeswimming track in probe test (n=17)

图3 （a）代表性的海马的显微照片；（b）～（d）海马在CA1、CA3、DG 区（n=3）中的神经元存活细胞计数Fig.3(a)Representative photomicrographsof thehippocampus;(b)～(d)Neuronal viablecells in hippocampal CA1,CA3,DG regions(n=3)

图4 （a）皮层和（b）海马中BDNF的定量变化；（c）皮层和（d）海马中BDNF表达的代表性条带；（e）免疫组化检测皮层和海马中BDNF的表达水平Fig.4 Relative BDNF level in the(a)cortex and(b)hippocampus;Representative images of BDNF expression in the(c)cortex and(d)hippocampus；(e) BDNFexpression in thecortex and hippocampusdetected by immunohistochemistry

2.4 TSA 抑制H 2O2诱导的原代星形胶质细胞损伤

星形胶质细胞的免疫荧光鉴定示于图5（a）。为了确定TSA 的有效浓度，将原代星形胶质细胞用浓度为0.001～20.0 μmol/L 的TSA 处理24 h。图5（b）中的Cell Counting Kit-8（CCK-8）分析表明5.0 μmol/L 或更低浓度的TSA 对细胞活力没有影响，而更高浓度（10.0μmol/L和20.0μmol/L）的TSA 则降低了细胞活力（分别为88.46%±2.675%，83.87%±2.520%）。因此，进一步选择0.001～5.0 μmol/L TSA 检测其在H2O2损伤中的保护作用。H2O2处理后，细胞活力显著降低至62.49%±1.722%，而0.01～5.0μmol/L TSA 显著逆转了H2O2诱导的细胞损伤，如图5（c）～5（e）中所示，TSA处理组提高了细胞活力，减少了LDH 释放，并且缓解了细胞形态损伤。

2.5 TSA 改善了线粒体功能障碍

图6（a）显示，在H2O2处理的星形胶质细胞中线粒体膜电位（MMP）明显下降，而5.0μmol/L TSA 使MMP恢复到了正常对照水平。由此推断TSA 抑制H2O2引起的MMP丢失，可能进一步改善线粒体能量代谢的功能障碍。ATP在细胞的各种生理和病理过程中起重要作用。通常，ATP水平下降表明线粒体功能受损[25]。图6（b）～6（d）显示，H2O2处理的星形胶质细胞和BCCAO组ATP均下降，TSA 预处理可以提高它们的ATP水平，表明TSA 在由H2O2和BCCAO引起的能量代谢紊乱中发挥保护作用。

图5 （a）免疫荧光染色；（b）通过CCK-8检测TSA 作用后细胞活力；（c）通过CCK-8测定H2O2 损伤时细胞活力；（d）LDH释放检测；（e）在显微镜下观察细胞形态变化Fig.5(a)Immunofluorescent staining;(b)Cell viability measured by CCK-8 assay after TSA treatment;(c)Cell viability detected by the assaysof CCK-8 in H2O2-induced injury;(d)LDH release;(e)Cellular morphology changesunder biological microscope

图6（e）和图6（f）中分别显示了皮层和海马中复合物I的活性。BCCAO大鼠的皮层和海马中复合物I的活性均降低，TSA 改善了其皮层和海马中复合物I的活性，但在多奈哌齐治疗的大鼠中未观察到显著变化。图6（g）和图6（h）中分别显示了皮层和海马中复合物IV 的活性。复合物IV 是ETC的末端电子受体，并参与ATP合成。在BCCAO组的皮层中观察到复合物IV 的活性显著增加，TSA 处理逆转了这种变化。与BCCAO组相比，TSA 和多奈哌齐均提高了海马中复合物I 和复合物IV 的活性，但数据未显示出显著差异。

2.6 TSA 抑制氧化还原紊乱并提高抗氧化能力

图7（a）所示为通过荧光显微镜观察的不同组的ROS、Hoechst33242、Merqed 荧光照片，半定量结果如图7（b）所示。与对照组的平均DCF荧光强度（3.93±1.044）相比，H2O2处理的星形胶质细胞中DCF荧光显著增加（12.81±1.610，P<0.001），表明有明显的ROS产生。TSA（0.1～5.0μmol/L）以剂量依赖性方式减弱了H2O2诱导的ROS的生成。检测TSA 对H2O2诱导的氧化应激中抗氧化的作用，如图7（c）所示，H2O2损伤明显提高了MDA 水平，表明H2O2组具有显著升高的脂质过氧化水平。同时，图7（d）、图7（e）显示，H2O2损伤降低了星形胶质细胞中SOD活性和GSH水平，TSA 处理可将这些变化显著逆转，表明TSA对H2O2诱导的氧化应激具有较强的抗氧化能力。

图6 （a） H2O2损伤模型中星形胶质细胞的MMP水平变化；（b）皮层（n=4）、（c）海马（n=3）和（d） H2O2损伤模型中星形胶质细胞中的ATP水平；（e）皮层（n=5）和（f）海马（n=3）中复合物I 的活性；（g）皮层（n=4）和（h）海马（n=4）中复合物IV 的活性Fig.6(a)MMP levels in the astrocytes with H2O2 injury; ATP levels in the(b)cortex(n=4)and(c) hippocampus(n=3),respectively;(d)ATPlevels in the astrocytes with H2O2 injury;Complex I activity in the(e)cortex(n=5)and(f)hippocampus(n=3);Complex IV activity in the(g)cortex (n=4)and (h)hippocampus( n=4)

图7 （a）荧光显微镜拍摄的ROS、Hoechst33242、Merqed 荧光照片；（b）平均DCF荧光强度；（c）MDA 水平；（d）SOD活性；（e）GSH 水平Fig.7(a)Fluorescence photos of ROS,Hoechst33242,Merqed by fluorescent microscope;(b)Mean DCF fluorescence intensity;(c)MDA level;(d)SODactivity;and (e)GSH level

3 讨 论

许多神经退行性疾病和神经元功能丧失与线粒体功能障碍有关[26]。在这项研究中，TSA 治疗显著逆转了BCCAO引起的认知缺陷（图2）以及CA1和CA3区的神经元丢失（图3）。除了神经营养作用外，BDNF还具有神经保护作用，包括抗凋亡、抗氧化和抑制自噬[27]。BDNF可以保护大鼠原代皮层细胞的线粒体功能[28]，据报道多奈哌齐可通过提高BDNF的表达来改善大鼠BCCAO模型的认知功能[29]。与先前的研究[30]一致，本文结果显示BCCAO大鼠的空间学习和认知能力明显下降。TSA 和多奈哌齐可增强脑组织中BDNF的水平（图4），表明BDNF的升高可能参与TSA 的促智和神经保护作用。

用100μmol/L H2O2处理的原代星形胶质细胞明显导致细胞活力下降、LDH 释放增加和异常形态变化（图5）。ROS异常升高可引起线粒体MMP降低，从而引起线粒体功能障碍，并加剧氧化还原状态的不平衡[31]，从而加速细胞ATP耗竭，继而引起线粒体膜通道孔（mPTP）的开放和细胞凋亡[32]。TSA 处理可以显著维持MMP 并改善ATP水平。TSA 可以显著逆转H2O2和BCCAO引起的氧化损伤，可能是通过改善ROS引起的代谢功能障碍和维持线粒体功能参数而实现的。

复合物I和复合物III是呼吸链中ROS的主要来源[33]。复合物IV 将电子转移到最终的电子受体，而复合物V 或ATP合酶则利用膜电位作为驱动力来产生ATP[34]。与先前的研究一致[35]，图6结果表明BCCAO可以显著降低线粒体复合体I 的活性。TSA可以提高脑组织（尤其是皮层）中复合物I的活性，表明它可以保护ETC复合物活性和ATP产生。有趣的是，我们发现BCCAO在皮层中具有明显增加的线粒体复合物IV 活性，这与以前的研究[35]不一致，而TSA 处理逆转了该变化。

H2O2是ROS的主要形式，也是氧化应激的诱因。在H2O2处理的星形胶质细胞中观察到明显的细胞内ROS积累现象。用H2O2处理后，脂质过氧化的生物标志物MDA 显著增加。在H2O2处理过的星形胶质细胞中观察到GSH 水平和SOD活性显著降低（图7），这可能进一步导致自由基清除和氧化还原失衡，进而刺激ROS的形成[36]。TSA 处理后ROS含量和MDA 水平降低，同时，SOD活性增加，GSH水平上调（图7）。因此，TSA 可以有效增强线粒体的生物能并改善氧化应激，该机制可能在TSA 改善脑灌注不足和氧化损伤中发挥重要作用。

总之，本文研究表明，TSA 可能通过维持线粒体功能和减轻ROS引起的氧化应激，从而增强抗氧化防御，对BCCAO和H2O2引起的氧化损伤发挥有效的神经保护作用。本文研究为TSA 在脑缺血、脑灌注不足引起的认知障碍的保护作用方面提供了新的证据。