锝[99mTc]GSA注射液血管刺激性和过敏性研究

孙鸽,张伟,黄立群,许文黎,高洁,刘欢,秦秀军,李建国

(中国辐射防护研究院GLP中心，太原，030006)

锝[99mTc]GSA注射液是99mTc 标记的注射亚锡半乳糖酰人血清白蛋白二亚乙基三胺五乙酸盐注射用溶液，是一种放射性显像剂，可特异性地对肝脏显像，可用于肝病的早期诊断以及肝脏代谢、生理和病理研究[1-2]。放射性诊断制剂因需在较短时间内达到目标组织器官进行显像，通常以静脉注射方式为主，以快速随血液循环系统到达全身，其特殊毒理包括刺激性和过敏性两方面。2021年，我国国家药品监督管理局颁布实施了《放射性体内诊断药物非临床研究技术指导原则》，规定了放射性体内诊断药物应开展的临床前评价内容，其中采用其最终制剂进行溶血性、刺激性和过敏性研究是必要内容[3]。本研究对锝[99mTc]GSA注射液开展临床前血管刺激性和全身主动过敏性研究，为放射性药物临床安全应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1受试物

锝[99mTc]GSA注射液为高锝[99mTc]酸钠溶液(Na99mTcO4)与GSA冻干制剂标记合成的注射用溶液，Na99mTcO4溶液由钼锝发生器淋洗制得，钼锝发生器由原子高科股份有限公司生产，批号20191207-1，活度18.5 GBq；GSA冻干药盒，北京师宏药物研制中心，规格3 mg/瓶，批号191024。

1.1.2实验动物

血管刺激性实验采用普通级日本大耳白兔6只，2.0～3.0 kg，动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0007。主动全身过敏性实验采用SPF级Hartley豚鼠，雌雄各20只，体重300～400 g，动物生产许可证号：SCXK(京)2017-0005。

动物均饲养于放射性实验设施普通环境内，实验动物使用许可证号：SYXK(晋)2019-0002，辐射安全许可证号：国环辐证(00346)。

1.1.3仪器设备

CRC-25R放射性核素活度计，美国CAPINTEC INC公司；Mini-Scan薄层扫描仪，美国 Eckert & Ziegler Radiopharma Inc 公司；Histocentre 3 石蜡包埋机、Finesse 325石蜡切片机、Excelsior全自动组织脱水机，英国Shandon；BX53荧光显微成像系统，日本Olympus公司。

Xγ 个人剂量报警仪，FJ-3200，剂量当量率0.1～500 mSv/h，青岛聚创环保集团有限公司生产；环境级Xγ 辐射测量仪，FJ-1200，0.01～200 μSv/h，中国辐射防护研究院生产；表面污染测量仪，FJ-1210，0～105 cps，中国辐射防护研究院生产；热释光个人剂量计，IDB-III，中国辐射防护研究院提供及定期检测。

1.2 实验方法

1.2.1血管刺激性实验

(1)溶液要求：血管刺激性实验理论设计浓度为临床拟用最大放射性浓度185 MBq/mL，给药时溶液放射性浓度误差应不大于10%，且放射化学纯度应大于90%。

(2)溶液制备过程：实验前，从钼锝发生器淋洗出新鲜Na99mTcO4溶液，以氯化钠注射液稀释至放射性浓度约200 MBq/mL，以1 mL/瓶加入到GSA冻干药盒，充分溶解，室温反应不少于5 min，标记完成后检测活度并取少量用于放射化学纯度分析，根据放射性核素衰变速度，需在30 min内完成给药。

(3)实验：实验使用普通级日本大耳白兔6只，采取同体左右侧自身对比法，每只兔左侧耳缘静脉给予受试物溶液，右侧给予等体积0.9%氯化钠注射液作为对照，受试物溶液放射性浓度184 MBq/mL，放射化学纯度100%，给药剂量为64 MBq/kg，单次给药。

(4)评价：给药期间及恢复期期间肉眼观察注射部位是否出现充血、水肿等刺激反应症状并评分，给药结束72 h后击打法处死3只动物，取材两侧耳缘静脉及周围组织，剩余动物继续恢复14天后取材，对兔耳进行组织病理学检查并分级(见表1)，计算给药结束和恢复期结束病理平均分级，评价受试物对血管是否具有刺激性，病理及刺激评分标准均依据《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》[4]，刺激程度与分级标准为：0.0～0.4为无刺激；0.5～1.4为轻微刺激；1.5～2.4为轻度刺激；2.5～3.4为中度刺激。

表1 血管刺激性实验病理组织分级标准

1.2.2主动全身过敏性实验

(1)溶液要求：主动全身过敏性实验高浓度和低浓度溶液理论设计分别为27.75 MBq/mL和9.25 MBq/mL，误差允许不大于10%，且溶液的放射化学纯度均应大于90%。

(2)溶液制备过程：每次实验前，从钼锝发生器淋洗出新鲜Na99mTcO4溶液，以氯化钠注射液稀释至放射性浓度约296 MBq/mL，以1 mL/瓶加入GSA冻干药盒，充分溶解，室温反应不少于5 min，标记完成后检测活度，以氯化钠注射液分别稀释至27.75 MBq/mL和9.25 MBq/mL，15 min内完成给药。经检测，三次致敏、两次激发给药前后供试品放射性浓度误差均小于10%，首次致敏前后低剂量和高剂量溶液的放化纯度范围为90.8%～100%，均大于90%，溶液均符合实验要求。

(3)实验：SPF级Hartley豚鼠40只，雌雄各半，依据体重分段随机均衡分为阴性对照组(0.9%氯化钠注射液)、阳性对照组(1%卵白蛋白)、低剂量(单次致敏剂量为13.2 MBq/kg，采用9.25 MBq/mL溶液)和高剂量(单次致敏剂量为39.6 MBq/kg，采用27.75 MBq/mL溶液)组。第1、3、5日腹腔注射0.5 mL/只致敏，末次致敏后第14、21日静脉注射1.0 mL/只激发，激发后30 min内观察动物是否出现过敏反应[4]。过敏反应症状及过敏程度判定标准见表2和表3。

表2 过敏反应症状

表3 全身致敏性评价标准

1.2.3人员防护装备及辐射监测

锝(99mTc)为γ辐射源，实验中主要采用铅屏蔽材料(0.1～10 mm铅当量)进行外照射的防护。核素制备和分装时操作者双手置于手套箱内，分装后的药物贮存于铅罐中进行传递，给药抽取和操作均位于铅屏风后方，所有实验参与人员必须穿戴铅衣、铅帽、铅围脖以及防护面罩等防护装备。实验过程中对淋洗、标记、药物分装和给药操作岗位的剂量率进行实时检测，实验期间(每季度)对所有放射性操作人员有效剂量进行监测。

2 结果

2.1 血管刺激性实验

实验期间，动物一般状态均良好，给药当日动物平均体重为2.9 kg，实验结束动物平均体重为3.1 kg，体重呈增长趋势。

给药后，6只动物给药侧和对照侧在操作部位(进针部位或针头活动部位)均出现轻度充血现象，给药结束后第5天全部恢复。病理结果显示，给药结束，对照侧有2例操作部位存在血栓形成或内皮细胞肿胀等，为轻微刺激范围，但药物作用部位均未见异常，所有动物给药侧耳缘静脉及其周围组织和血管均未见异常，平均分为0，均为无刺激性；恢复期结束，3只动物耳缘静脉及其周围组织和血管均未见异常。

2.2 主动全身过敏性实验

致敏期间，豚鼠一般状态良好，至实验结束，各组豚鼠平均体重均呈增长趋势，实验期动物各组平均体重无统计学差异。

两次激发，阴性对照组8只动物均未观察到过敏反应症状，呈阴性，阳性对照组8只动物呈极强阳性，阳性发生率100%。(1)首次激发，低剂量组2只动物未见明显异常，1只动物激发后3 min死亡，1只出现颤抖，30 min内恢复，高剂量组4只动物均出现咳嗽、痉挛、跳跃过敏反应症状，其中3只激发后3 min内死亡；(2)末次激发，低剂量组3只动物未见明显异常，1只极强阳性反应死亡；高剂量组有1只无明显反应，3只动物出现颤抖、步态不稳，其中1只最后死亡，其余2只30 min内恢复。取未致敏组动物给予高剂量组和低剂量组溶液1.0 mL/只，动物均未见过敏反应发生。详见表4。

表4 主动全身过敏性实验激发结果

3 讨论

诊断试剂是指用于诊断或监测疾病的药品，用于评价药品有效性、安全性、质量可控性的原则同样适用于诊断试剂，亦需考虑评估与诊断试剂使用有关的获益和风险。放射性诊断药物通常包括放射性核素和标记底物两个部分，本研究中的锝[99mTc]GSA注射液就包括高锝[99mTc]酸钠和GSA两种主要成分，实验设计要兼顾GSA药盒化学和辐射剂量学2个方面[5]，给药前对标记后受试物溶液的质量进行合理控制[6]，在血管刺激和主动全身过敏性实验中，放射化学纯度均大于90%，给药阶段受试物溶液的放射性浓度均控制在误差10%以内，表明在给药时效性和核素标记有效性方面均符合实验要求。

放射性诊断药物通常单次使用，且注射过程中常首先建立生理盐水静注通道，确认注射针头进入血管后再快速推注药物，给药后再对血管进行灌注冲洗，以防止药液外渗和降低血管刺激性。本研究给药后肉眼观察到对照侧和给药侧操作部位的轻度充血现象，给药后症状逐渐消失，给药结束72 h 有2例对照侧操作部位出现血栓形成或内皮细胞肿胀等轻度病理变化，可能与注射操作或给药后止血时间短相关，且所有动物药物作用部位均未见异常，显示受试物单次使用后对兔耳缘静脉未见引起刺激反应，证明锝[99mTc]GSA注射液注射对血管的局部安全性。主动皮肤过敏性研究，豚鼠出现强阳性过敏反应甚至极强阳性而死亡，与受试物本身性质相关，锝[99mTc]GSA注射液含人血清白蛋白，人血白蛋白和卵白蛋白为《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》推荐的两种主动全身过敏实验可采用的致敏阳性物质，且受试物对豚鼠为异源蛋白，重复使用会引起豚鼠强过敏反应发生，在高梅等[7]的研究中亦表明人血白蛋白、卵白蛋白在2～100 mg/只剂量范围内，豚鼠主动全身过敏反应的发生率为100%。实验中正常动物给予激发剂量的受试物后，未见过敏反应发生，但豚鼠经重复致敏后二周内可产生特异性IgE抗体，致敏后2～3周静脉输入同种抗原，引起速发型超敏反应发生，结果提示，一方面放射性诊断制剂临床单次使用引起患者过敏反应较低，另一方面临床4周内多次使用可能引起患者速发型过敏反应发生，严重者可能出现过敏性休克甚至短时间内死亡，应密切观察。

实验过程中，各工作位点辐射剂量率监测结果显示，淋洗、标记和给药作业人员操作位剂量率较高，最高值为24.925 μSv/h，药物抽取、分装台面污染最严重，但污染水平均能低于控制值要求(小于40 Bq/cm2)，操作人员是在铅屏蔽等防护条件下进行，季度有效剂量均远远低于职业人员年有效剂量限值[8-9]，表明采取的各项防护措施可保障人员辐射安全。由于放射性药物是带有放射性的特殊制剂，在实际操作中应根据不同核素性质采取不同防护措施，例如本研究中锝[99mTc]GSA注射液为低毒类放射性诊断药物，锝[99mTc]主要发射低能量 γ 射线，可穿透机体和空气介质，实验操作人员存在潜在暴露风险，这就要求操作过程穿戴铅衣、铅围脖等个人防护装备，实施严格的个人受照剂量监测以及环境污染的监测[10-11]；操作125I和131I药物形成的放射性碘蒸气容易形成放射性气溶胶，引起严重的放射污染，这些放射性气溶胶可以通过粘附人体产生外照射以及被人体吸入产生内照射，这就要求操作过程中佩戴防护面罩、保持室内通风以及加强污染监测等措施[12]。

对于放射性显像药物的临床前安全性评价最初主要依据美国食品药品监督管理局(FDA)《Developing Medical Imaging Drug and Biological Products Part 1: Conducting Safety Assessments》[13]对制剂的安全性进行规范化的研究，其中的注射剂也需进行血液相容性和刺激性以及过敏性的评估和研究。目前我国国家药监局药审中心2020年颁布实施的《放射性体内诊断药物非临床研究技术指导原则》对注射剂的临床前安全性评价做了详细全面的阐述，使放射性诊断药物的临床前安全研究具备较为统一和完善的政策和法规指导。