VX2兔肝癌原位模型与肝动脉介入放射性栓塞微球方法的建立及辐射防护策略

王志鹏,尹晶晶,许文黎,孙鸽,高洁,张伟,秦秀军,李建国,刘欢

(中国辐射防护研究院药物安全性评价中心，太原，030006)

原发性肝癌(PLC)是一种最常见的恶性肿瘤，我国每年有约13万人死于原发性肝癌[1]。目前肝癌的临床治疗主要包括手术切除、放疗、化疗、靶向治疗等。近年来，放疗栓塞治疗(TARE)，因其能够将放射性药物精准栓塞于肿瘤部位，成为临床应用研究的热点[2]。但是相关疗法和药物的研发，需要类似人肝癌转移的动物模型和相关介入疗法的临床前试验来验证其安全性和有效性。VX2兔肝癌原位模型是迄今为止唯一能够在较大动物建立的肝转移性肿瘤模型，该模型多用于肝脏肿瘤的影像学和治疗学研究[3-6]。该模型肿瘤发展过程与人肝癌相似，是最理想的肝癌实验模型，在该模型上开发出的药物和疗法对指导临床选择肿瘤治疗方案有重大意义。目前临床上介入手术相当成熟，且主要集中于栓塞治疗，但目前我国仍然没有TARE相关药物，缺乏TARE临床经验，因此对于VX2兔肝癌原位模型进行TARE的方法建立尤为重要，能够为临床治疗提供重要参考价值[7]。

1 实验材料

1.1 实验动物

新西兰大白兔8只，雌雄各半；5～6月龄，北京市昌扬西山养殖场 SCXK(京)2016-0007；兔VX2肝癌瘤块来源于东南大学；实验动物饲养于中国辐射防护研究院放射性实验动物设施普通环境，单笼饲养SYXK(晋)2019-0002，辐射安全许可证号：国环辐证(00346)。

1.2 主要仪器和试剂

盐酸利多卡因注射液，山东华鲁制药有限公司；眼科剪，扬州市华宏医疗器械有限公司；GE Light Speed 64层螺旋CT扫描仪，美国 GE公司；碘帕醇注射液，上海博莱科信谊药业有限责任公司；肝素钠注射液，天津生物化学制药有限公司；DSA，美国 GE公司。放射性90Y微球，按照全肝吸收剂量100 Gy进行给药，90Y为理想的治疗用放射性核素，半衰期为64 h，释放纯β辐射(2.288 MeV)。目前上市的90Y 微球主要有90Y-玻璃微球和90Y-树脂微球，临床用于治疗晚期肝癌，给药途径为肝动脉介入给药[8]。

2 实验方法

2.1 兔VX2肝癌模型建立

将瘤块于37 ℃下解冻，先将瘤块上的坏死组织和肌肉组织去除，然后将瘤块上的鱼肉样组织剪碎成大小约为1～2 mm3小块，将其浸泡在无菌盐水中，用注射器抽取瘤块。

采用开腹直视下瘤组织块穿刺注入法接种。实验兔接种前12小时禁食但不禁水，术前给予兔戊巴比妥钠麻醉，在以标准外科方式准备和覆盖腹部后，用小刀片做垂直方向的剑突下小切口，并使用钝性剥离通过无血管白线暴露腹膜，仔细划分腹膜可以看到肝脏，逐层入腹，暴露肝脏下缘。使用扩开器将切口扩开，动作温和的将暴露肝脏内侧段和外侧段拉出体外，注意避免肝包膜撕裂，暴露的器官应用湿纱布保持湿润。将含有瘤块的注射器换用18G穿刺针斜穿刺入肝左叶，注射瘤块混合液0.1 mL，随后迅速拔出穿刺针，穿刺点渗出的少量血用无菌棉签压迫止血。将肝脏左页放回体内后，逐层缝合腹膜、肌肉、皮肤。缝合后在皮肤创口处涂撒少量注射青霉素粉针剂。术后连续4天在实验兔大腿外侧肌群注射青霉素，并用碘伏擦拭手术创口来预防感染。

2.2 CT肿瘤观察

接种后14天，将动物麻醉后置于螺旋CT下进行胸腹部扫描。CT参数为管电压 80 kV，管电流 60 mA。先平扫定位，后序贯动态三期增强扫描，采集时间分别为动脉期(15 s)、静脉期(25 s)和延迟期(45 s)。

2.3 VX2兔肝癌原位模型介入给予放射性微球

随机选取4只动物开展介入给予放射性微球试验。将模型兔麻醉后，平躺体位将四肢拉直，将动物固定于手术台，先用手触摸找出股动脉位置，再用手术刀逐层切开皮肤，分离出股动脉；用穿刺针穿刺股动脉，并置入5F动脉鞘后立即插入2.7F微导管避免动物失血，用手术缝合线将血管鞘与股动脉结扎固定。操作导丝末端手柄将导管导丝送至肝总动脉。于DSA仪器下进行碘帕醇注射液造影，确认微导管位置是否在肝总动脉，并确认附近血管走形找出肝固有动脉的位置；之后继续操作微导丝上行至肝固有动脉，进行碘帕醇注射液造影，确认肝脏轮廓和肿瘤轮廓。

上述操作确认微导管行至肝固有动脉后，将导管位置固定，使用三通连接器连接装有放射性微球的注射器、装有生理盐水的注射器和微导管，缓慢推注给药。装有放射性微球的注射器装入注射器铅防护套。给药后用三通连接器连接的生理盐水冲洗微导管。给药后再次使用碘帕醇注射液造影，观察肝脏和肿瘤血管栓塞情况。上述操作结束后拔出微导管和血管鞘，将股动脉穿刺位置前后1 cm处结扎，结扎股动脉穿刺位置，逐层缝合肌肉、皮肤。缝合后在皮肤创口处涂撒少量注射青霉素粉针剂。术后连续4天在实验兔大腿外侧肌群注射青霉素，并用碘伏擦拭手术创口来预防感染。

3 结果

3.1 VX2兔肝癌原位模型构建及生长情况

动物接种试验后，有3只动物出现伤口发炎情况，14天后CT检查时可见所有动物肝脏部位均有低密度结节，判断为肿瘤，肿瘤平均直径为1.2 cm。CT结果表明，VX2兔肝癌原位模型构建成功，且成功率达100%。

未进行介入给予放射性微球的4只荷瘤兔于瘤块种植后30天解剖检查，可见肝脏肿瘤接种部位有直径较大的实质肿物，同叶肝脏有多处转移灶，在肝脏网膜、腹壁开腹部位、肺脏可见多处转移病灶。结果表明，本实验所用方法构建的VX2兔肝癌原位模型成功，且成功率达100%，未见动物因感染和手术因素死亡。

3.2 VX2兔肝癌原位模型介入给予放射性微球

VX2兔肝癌原位模型肿瘤为富血管瘤，经DSA下造影检查，可见肝脏部位清晰的肿瘤轮廓为球状，且其中血管极其丰富。在肝总动脉入口进行碘帕醇造影，可见在腹腔干动脉上的主要血管走形，在分支中较细的一支行向左下为脾动脉，胃左和肝总动脉共行一段，之后胃左动脉行于胃小弯，肝总动脉向右上走行；肝总动脉之后分出胃十二指肠动脉和肝固有动脉，微导管行至此肝固有动脉(即供养肝脏肿瘤的血管)，再次使用碘帕醇造影检查，可见血管显象出肝脏轮廓，且肿瘤清晰可见，将导管位置固定后使用三通连接器连接装有放射性药物的注射器、装有生理盐水的注射器和微导管，缓慢推注给药。给药后再次造影，可以看到之前清晰的肿瘤轮廓变成只有外周一圈的轮廓，内部不可见丰富的血管，表明药物进入肿瘤组织，且将肿瘤内部血管栓塞，表明给药成功。

将试验动物于给药后16天解剖检查，可见动物肝脏肿瘤接种位置有直径较大实质肿物，但同叶肝脏、肺脏均无转移灶，在肝脏网膜可见少许转移病灶。

4 放射微球介入试验操作中的辐射防护策略

因为药物具有放射性且DSA机器亦通过释放X射线进行显像，因此在整个给药过程中操作人员的受照剂量会很高，在相关操作中应注意人员防护，采取屏蔽防护、时间防护、距离防护相结合的方式，最大可能保护操作人员。

屏蔽防护：在DSA机器球管与介入手术操作人员之间增加10 mm的铅防护，在动物固定台于动物下腹部部位增加3 mm的铅防护，人员穿戴铅防护服(0.5 mm Pb)，穿戴铅防护手套(0.02 mm Pb)，佩戴铅眼镜(0.5 mm Pb)。

时间防护：热药试验前先进行冷药的模拟试验，使各岗位人员能熟练操作缩短操作时间，热药试验时将各个环节分解为流水线操作，保证人员接触放射性药物时间最短化，在介入手术和给药环节进行人员轮岗工作，每人一只。

距离防护：人员在给药后进行缝合、清创、观察、清洁等操作时进行铅帘(0.5 mm Pb)屏蔽，并保持一定距离，饲养期间动物个体之间保持大于2 m的距离。上述试验的注意事项以及相关防护措施能够为我国非临床TARE的相关药效学和毒理学试验操作提供一些经验和建议。

5 讨论

为了确保VX2兔肝癌原位模型成功建立，需要注意以下几点：(1)选取靠近肿瘤边缘生长旺盛的质嫩灰白色鱼肉样组织进行移植，能够相应的提高肿瘤细胞的成活率；(2)建模前对动物进行禁食，可以减小实验动物的肠道返流，避免不必要的不良反应；(3)于肝左叶进行肿瘤组织植入，肝左叶血液丰富体积较大，有利于肿瘤组织生长。

肝动脉介入试验操作中需要注意：(1)为减小试验人员受照剂量，采取双人配合操作，需先进行模拟训练，提高配合默契度，提高操作成功率；(2)造影找到肝固有动脉后，尽量继续上行导丝导管至肝左动脉，使药物能够更好的富集于肝左叶肿瘤部位，但是在继续上行过程中需要极其缓慢小心，肝左动脉很细小稍有不慎就会引起血管破裂。

放射微球药物给药时注意：采用三通连接器，尽量减少不必要的污染，在微球给药时应将微导固定，避免位移，之后需要将抽好药量的注射器进行稀释，避免浓度较大的微球堵塞微导管，在给药后用适量生理盐水冲洗导管，将微导管内的残留要物冲洗到肝脏；

放射性药物介入操作和放射性微球给药操作中的辐射防护策略，可以用于其他放射性药物的非临床研究中。