同位素标记的靶向药物体外筛选研究

黄立群,李曙芳,周文华,孙鸽,秦秀军,李建国

(中国辐射防护研究院GLP中心，太原，030006)

0 引言

药物筛选是新药研究开发的起点和重要环节，筛选的靶点包括受体、酶、离子通道等，其中受体参与机体的各种生理和病理过程，是药物筛选的主要靶标之一[1]。受体是细胞表面或细胞内识别、接收、传递、放大信号的一类生物大分子，能引起靶细胞产生生物效应。受体与配体的相互作用具有高特异性、高选择性、高亲和性、饱和性和可逆性等特点，现有药物中超过50%的药物以受体为作用靶点[2]。

单克隆抗体、多肽等配体标记放射性核素后，通过与受体的特异性结合可以达到显像或治疗的目的。药物筛选是通过规范化的实验手段从大量化合物或新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性化合物的过程，成像技术的发展使得基于荧光标记和配体的检测成为可能，尽管荧光标记法已广泛用于细胞亲和性实验，但基于同位素标记的亲和性试验具有灵敏度高、专一性好、更好模拟核素标记靶向性等特点[3]。蛋白质配体-受体的作用本质上是蛋白质的相互作用，其亲和性基于蛋白质相互作用的理论，但实际操作中要想精确测定面临许多挑战[4]。其中最重要的两点是亲和反应的平衡时间和配体的消耗，亲和反应的平衡高度依赖于配体的浓度和亲和性的强弱，通常需要数小时达到平衡；亲和性的精确测定需要对平衡时自由配体的浓度进行测定，通常假定实验起始时的配体浓度等于平衡时自由配体的浓度，这个假设成立的前提是系统中起始配体的浓度远远大于受体的浓度，如果配体消耗较多，会导致亲和曲线右移，使解离常数Kd较实际值偏大，只有基于合适的体系，才能准确测定配体-受体的亲和性[5]。

PSMA-617是已递交FDA上市申请的PSMA靶向药物，用于转移性去势抵抗性前列腺癌的靶向放射配体治疗，其结构包含3部分，左侧为PSMA靶向单元，右侧为DOTA结构，用于螯合金属离子，中间部分为连接结构。PSMA-617结构图见图1。本实验在离体条件下，基于人前列腺癌LNCaP细胞表面前列腺癌细胞膜抗原(PSMA)靶点，通过与125I标记的靶向药物A(由PSMA-617右侧单元改为酪胺基团而成，用于125I的标记)的竞争性结合，筛选特异性结合的靶向配体，并比较其亲和性大小，从而建立靶向药物的体外同位素标记筛选方法。

图1 PSMA-617结构图

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

人前列腺癌细胞，南京科佰生物科技有限公司。RPMI 1640培养基、胎牛血清、青链霉素、胰酶，Gibco公司。磷酸缓冲液，上海生工生物工程有限公司。DMSO，索莱宝生物技术有限公司。Na125I溶液，中国同辐股份有限公司。多孔过滤板、筛选架，Millipore公司。化合物A为靶向PSMA已知配体，B、C、D和E为待测配体，对PSMA-617靶向单元进行了改进，亲和特异性未知。

1.2 实验系统

人前列腺癌细胞，用含有15%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，每2天更换培养基，当细胞融合度达到90%以上时按照1∶3传代，细胞生长融合度达到70%～80%时用于实验。

1.3 125I标记与质控

125I标记采用氯胺-T法，吸取1 nmol的多肽溶液，2.0 mCi的Na125I溶液充分混匀，在混合液中加入14 μL的氯胺-T溶液，混匀后室温静置5 min，加入2 μL的抗坏血酸钠溶液，混匀2 min，加入HLB柱抽提，经2次纯化后使用。薄层层析法检测标记化合物的放化纯度。

1.4 实验方法

1.4.1实验准备

(1)Binding buffer 溶液配制：取47.5 mL RPMI 1640培养基，加入2.5 mL 5%BSA溶液，混匀待用，现用现配。

(2)125I标记配体工作液配制：根据原溶液放射性活度浓度用Binding Buffer溶液稀释混匀，配制成放射性浓度约为0.4 μCi/mL的125I-A放射性标记配体工作液，现配现用。

(3)配体工作液配制：A-D配制成浓度为2 000 μmol/L的储备液，吸取储备液5 μL，加入245 μL Binding buffer溶液中，混匀配制成40 μmol/L的工作液。依次取20 μL按10倍梯度用Binding buffer溶液，按10倍梯度逐级稀释，配制配体工作液，现配现用。

1.4.2剂量与分组

设计空白对照组(不含细胞)、阳性对照组(含细胞，不含配体)、化合物组，化合物组包括待测配体B、C、D、E及参考配体A，每种化合物分别设置6组，组1、组2、组3、组4、组5、组6的配体溶液终浓度分别为0.1、1、10、100、1 000、10 000 nM。

1.4.3亲和性试验

将对数生长期细胞用Binding buffer(RPMI 1640加上0.25%BSA，防止非特异性结合)溶液悬浮配制成浓度为(1～3)×106个/mL的细胞悬液，以每孔100 μL的量将细胞悬液接种于96孔过滤板中(空白组除外，空白组加入150 μL的Binding buffer)。每孔中分别加入50 μL的125I-A放射性标记化合物(每孔总放射性活度约0.02 μCi)。化合物组分别加入50 μL系列梯度浓度工作液，阳性对照组加入50 μL的Binding buffer。每个浓度和组别均设3个复孔。以参考配体A为例，每组化合物的试验体系中各种组分加样体积列于表1。

表1 每组化合物的试验体系中各种组分加样体积(以参考配体A为例)

在37 ℃培养箱中孵育1 h后抽滤，每孔加入200 μL Binding buffer溶液清洗抽滤3次。将板托取下晾干后，小心撕下滤膜放置于离心管底部，γ-counting检测计数。

1.4.4结果统计与分析

计算公式：

式中，Cs为系列浓度受试物放射性计数；Cc为阳性对照组放射性计数；Cb为空白对照组放射性计数。

以125I-A结合率为纵坐标，logM浓度为横坐标，通过GraphPad Prism5.0线性回归分析计算受试物的IC50浓度(即竞争性结合50%125I-A的受试物浓度)，建立拟合曲线计算IC50。

根据IC50值大小可以判断化合物与PSMA靶点亲和性的相对大小，IC50越小，化合物与PSMA靶点的亲和性越高。

2 实验结果

2.1 125I-A标记及质量控制

125I-A标记放化纯度检测结果见图2。放射化学纯度受制备方法及原料的化学纯度、产物存放条件等影响，对于体外筛选研究，一般放化纯度控制在90%以上。由图2可见，125I-A的标记放化纯度达到了91.92%，满足体外筛选实验需要。将醇洗馏分加入含0.5% VC-Na的pH 7.5磷酸溶液中，混匀后分装保存于-80 ℃，可稳定保存1个月以上。

图2 125I-A标记放化纯度

2.2 亲和性实验结果

化合物A、B、C、D、E的竞争性结合拟合曲线见图3，IC50值列于表2。由表2可见，与PSMA靶点的亲和性由大到小的化合物为：C>B>A>D>E，即化合物C与PSMA靶点的亲和性最高。

表2 化合物的LogIC50和IC50拟合值

图3 化合物的竞争性结合拟合曲线图

亲和性试验中必须考虑非特异性结合，放射性配体除了结合我们感兴趣的靶点外，还可以与其他物质非特异的结合，如细胞膜、多孔板、滤膜甚至其他受体等，从而产生不依赖于靶点的“背景”信号。非特异性结合的水平可以通过增加非标记配体量从而完全占据结合靶点(替代放射性配体)时的放射性计数进行测定。理想的亲和性实验中，放射性配体应有较高亲和性，较低的非特异性结合，高度的特异性结合(70%～100%)。降低非特异性结合可以提高特异性结合比率，通常降低非特异性结合的方法有：控制反应体系中受体的含量，非特异性结合通常随着受体浓度的增加而增加；多孔板使用BSA或聚乙烯预处理可以降低非特异性吸附；另外过滤和缓冲液的清洗可以清除大多数非特异性结合信号。本实验中，Binding buffer中添加了0.25%BSA，最后buffer清洗3次可以显著降低非特异性结合，对于管壁和滤膜的非特异性吸附通过设定空白组，计算特异性结合率时进行了扣除，最终特异性结合率控制在了85%以上，满足亲和性试验要求。

3 讨论

与基于可溶性蛋白质的体外实验相比，基于细胞的配体-受体亲和性试验具有内源性的优点，可以防止受体形成复合物，影响亲和实验结果[6]。细胞亲和性实验有直接测定法和竞争性结合测定法，直接测定法是将系列梯度浓度的标记化合物与细胞共同孵育，达到平衡后分离上清液，测定细胞的标记化合物含量，根据结合率计算亲和性曲线。竞争性结合是在上述体系中引入定量的标记配体，待测配体与标记配体竞争性结合细胞表面受体，最后测定细胞表面竞争性配体的含量，建立竞争性拟合曲线图，求得IC50值，由Cheng-Prusoff方程可以计算化合物的Kd值

方程中已知竞争性配体的Kdcompetitor值和竞争性配体的浓度，根据测得的IC50值，可以间接求得待测化合物的Kd值,但应注意竞争性配体的Kdcompetitor值必须是基于同样条件下在同种细胞内测得的结果[7]。无论直接或者间接方法，尽管亲和性试验容易开展，但Kd值的精确测定仍面临挑战，受操作者和试验条件的影响较大。但在早期候选药物筛选过程中，依据竞争性结合实验测得的IC50值判断其亲和性相对大小，可以满足早期候选化合物筛选的需要。

药物筛选中常使用的放射性同位素有14C、3H、125I、131I等，在使用上各有优缺点，可根据标记物、供应和实验要求选择合适的核素。使用C和H标记不改变化合物的结构及免疫学活性，且半衰期很长，制备的标记物可以长时间放置，但标记过程较为复杂，难以获得高比放射性的标记物，并且衰变产生弱β射线，需要液体闪烁计数器才能准确测量，测量步骤繁琐，对于碘标记容易丧失免疫化学或生物活性的药物才考虑使用该方法[8]。碘供应的方便性、较低的价格及高效率的样本检测使其成为药物筛选试验中最常用的核素，相较于131I，125I的使用有更多的优势，首先，半衰期适中，允许核素和标记化合物的贮存和应用；其次衰变发射低能γ射线，辐射自分解少，标记化合物能稳定贮存，同时对操作人员的防护要求较低。