蜘蛛多肽类毒素异源表达的研究进展＊

王 浩，刘燕波，李文颖，孟 尔，2，柳 珑

(1.国防科学技术大学理学院，湖南长沙 410073;2.湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙 410006)

蜘蛛多肽类毒素异源表达的研究进展＊

王 浩1*，刘燕波2*，李文颖1，孟 尔1，2，柳 珑1

(1.国防科学技术大学理学院，湖南长沙 410073;2.湖南师范大学生命科学学院，湖南长沙 410006)

蜘蛛毒液是一个巨大的天然多肽和蛋白质分子组合库，具有多种生物学功能.但仅靠从天然的蜘蛛中提取出研究所需的蜘蛛多肽类毒素远不能满足对其的全面研究和开发利用.相比化学的固相合成法合成的低产量和较高成本，利用基因工程的方法异源表达蜘蛛毒素有较大的优势.综述了近年来利用大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统和植物表达系统异源表达蜘蛛毒素的研究进展.

蜘蛛多肽类毒素;胞内表达;分泌表达

蜘蛛在分类学上属于节肢动物门，蛛形纲，蜘蛛目.蜘蛛是世界上最古老的物种之一，其种类数目仅次于昆虫，分布也极为广泛.据统计全世界共发现蜘蛛40000多种［1］.除了hackled orbweavers(Uloboridae)和primitive mesothelids中的某些种类外，其它所有蜘蛛都具有毒腺［2］.蜘蛛毒液成分较多，依据其理化性质可分为多肽类与多胺类.多肽类神经毒素根据分子量的大小又可以分为高分子量毒素和低分子量毒素两类［3］:高分子量毒素存在于黑寡妇蜘蛛毒液中，如α－latrotoxin，相对分子质量在100 Da以上，能作用于突触前膜，并促使神经递质的大量释放;低分子量毒素相对分子质量相对较小，一般在100×103～12×103Da之间，可与Na+、K+、Ca2+等各种离子通道相互作用.蜘蛛毒液是一个巨大的天然组合库，它们具有多种生物学功能;开发蜘蛛毒液这个宝藏，很可能发现一些药物先导分子、药理学研究的工具试剂和生物杀虫剂等.

目前研究用的蜘蛛毒素大部分从天然的粗毒中提取出来或用固相合成法获得，但随着环境的改变，蜘蛛的种类和数量急剧减少，仅靠天然资源远不能满足对毒素的全面研究和开发利用的需要.利用固相合成法合成蜘蛛毒素，每次合成量有限，并且试剂昂贵，成本很高.所以采用基因工程的方法来表达这些蜘蛛毒素多肽基因就变得尤为重要.目前，比较成熟的表达系统包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和植物表达系统.

1 大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统是目前掌握最为成熟的原核表达系统，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点.大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种.大肠杆菌表达系统的宿主细菌大部分是大肠杆菌BL21(DE3)以及其衍生菌种.

近年来，一些编码低分子量的蜘蛛毒素基因在大肠杆菌胞内表达系统中得到成功表达的例子多有报导.1993年Diniz，M.R.等人利用表达载体pET32c(+)在大肠杆菌AD494(DE3)pLysS中成功表达出Phoneutria nigriventer的钠离子通道抑制剂 Txl［4］.2003 年 Carneiro，A.M.等人用质粒 pMAL －c2在胞内成功表达出PnTx3－1，其N端有一个42.7 kDa的麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合蛋白［5］.2011年孟尔等人用表达质粒 pET－40b成功表达出虎纹捕鸟毒素 －Ⅰ［6］(HWTX－Ⅰ).此外，利用大肠杆菌表达系统也表达了一些编码较大分子量的蜘蛛蛋白基因.蜘蛛Loxosceles intermedia中的皮肤坏死毒素:磷脂酶 D(33 kDa)、LiRecDT2(33.8 kDa)、LiRecDT3(34 kDa)、LiRecDT4(34 kDa)和 LiRecDT5(37 kDa)利用表达载体 pET －14b成功表达［7－9］;大肠杆菌胞内表达系统也有它的缺陷，主要表现在目的蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成与蛋白糖基化，因此通过大肠杆菌表达系统异源表达的含二硫键的多肽蜘蛛毒素不具有生物活性的几率较大.2000年李敏等用pGEX－KT成功地将HWTX－I与GST融合表达，但由于在表达过程中没有形成三对二硫键，导致最后得到的表达产量较低且生物学活性明显低于天然毒素［10］.不过可以采取大肠杆菌的周质表达来解决二硫键配对的问题，已经有研究表明在大肠杆菌周质中，能成功获取具有和天然功能一致的 HWTX－I与HWTX － IV［6，11］.

2 酵母表达系统

酵母表达系统是一种兼具原核以及真核表达系统的优点的外源蛋白表达系统，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，高密发酵等优点.用酵母表达系统表达蜘蛛毒素基因的例子还不是很多.将来源于Gramostola spatulata的编码毒素GsMTx4的基因利用质粒pPICZα在毕赤酵母中成功分泌表达，表达量为100 mg/L，毒素的功能是缓解机械和神经性疼痛［12］.Fitches，E.等人用表达质粒pGAPZaA在野生型的X33毕赤酵母株中也分泌表达出杀虫肽SFIl，在X33和SMDll68H株中融合表达SFI1/GNA(GNA是雪莲花凝集素)［13］，实验证明表达产物对Nllaparvata lugens的幼虫有毒害作用［14］.2002年聂东宋等用表达质粒pPIC9K在毕赤酵母中成功表达自虎纹捕鸟蛛的编码HWTX－I的基因，表达量达到80 mg/L，但表达产物N端多余4个氨基酸残基，且C端不均一［15］;彭宽等用表达质粒pVT102U/α在酿酒酵母S78株中成功表达自虎纹蜘蛛的毒素HWTX－XI基因，表达产物和天然毒素一致，且形成了正确的二硫键［16］.

表1 部分已表达的蜘蛛毒素

3 昆虫表达系统

昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统.利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达.它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白;其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%;可表达非常大的外源性基因(约200 kDa);昆虫杆状病毒表达系统常用的杆状病毒包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕型多角体病毒(BmNPV)，常用的宿主细胞则来源于草地夜蛾Sf9细胞，用于表达外源基因的质粒来源于PUC系列，其含有一个多克隆位点和多角体蛋白启动子.目前采用昆虫杆状病毒表达系统表达蜘蛛毒素的报道不多.Grishin等将来源于黑寡妇蜘蛛(Latrodectus tredecYmguttatus)的毒素α－LTX的cDNA克隆入转移载体pMelBacA，转入Sf9细胞，同源重组形成重组的杆状病毒AcMNPv－α－LTX－M，经PCR鉴定后，转入Hi5细胞进行大量表达，表达量为每升细胞培养液0.2 －0.3 mg目的蛋白［17］.通过 SDS电泳及质谱鉴定毒素α－LTX的分子量为131 kDa，这样的大分子量蛋白质，如果采用大肠杆菌表达系统可能会由于目的蛋白质不能正确的折叠导致表达失败.但通过昆虫杆状病毒表达系统表达得到的产物则具有和天然毒素一样的功能;Ji等把编码HWTX－I的成熟肽基因序列克隆到质粒pFastbacl中，转化入感受态细胞DH10Bac中，接着用重组的杆状病毒质粒转入Sf9细胞进行表达，表达产物也具有和天然毒素相似的生物功能［18］.

4 植物表达系统

植物能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质，易于大规模培养和生产，且在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势.由于利用植物表达外源性蛋白起步较晚目前，来源于蜘蛛的抗虫基因构建的转基因植物报道还相对较少.2006年Khan，S.A等人利用表达质粒pGreen0029在烟草中成功表达出蜘蛛Htadronyehe versuta的昆虫特异的钙离子通道抑制剂 ω －ACTX －Hvla［19］.

5 小结与展望

从目前的研究来看，利用大肠杆菌表达系统表达蜘蛛毒素应用得最为广泛，且多用于表达分子量较小的毒素.而酵母表达系统、昆虫表达系统等真核表达系统则在表达分子量相对较大的毒素方面更容易获得成功.虽然目前只有一小部分的蜘蛛毒素多肽基因可以通过基因工程的手段实现异源表达，甚至有的毒素基因表达出来的产物并不完全具备天然毒素的生理活性.但是我们仍然能从这些成功例子中看出采用基因工程的方法来表达蜘蛛毒素多肽基因是我们获取蜘蛛毒素的一个行之有效的方法，也是未来具有较大发展的一个方法.

［1］黄仁槐，梁宋平.蜘蛛多肽神经毒素研究新进展［J］.生命科学研究，2000，(2):1 －8.

［2］蒋立平.虎纹捕鸟蛛毒素的基因克隆、表达及功能研究［D］.长沙:湖南师范大学博士学位论文，2008.

［3］Grinshine V.Polypeptide neurotoxins from spider venoms［J］.European Journal of Biochemistry，1999，(2):276 －280.

［4］Diniz M R，Paine M J，Diniz C R，et al.Sequence of the cDNA coding for the lethal neurotoxin Tx1 from the Brazilian“armed”spider Phoneutria nigriventer predicts the synthesis and processing of a preprotoxin［J］.The Journal of Biological Chemistry，1993，(21):15340 －15342.

［5］Carneiro A M，Kushmerick C，Koenen J，et al.Expression of a functional recombinant Phoneutria nigriventer toxin active on K+channels［J］.Toxicon，2003，(3):305 －313.

［6］Meng Er，Cai T，Li W，et al.Functional expression of spider neurotoxic peptide huwentoxin － I in E.coli［J］.PLoS ONE，2011，(6):e21608.

［7］Da Silveira R B，Pigozzo R B，Chaim O M，et al.Molecular cloning and functional characterization of two isoforms of dermonecrotic toxin from Loxosceles intermedia(brown spider)venom gland［J］.Biochimie，2006，(9):1241 －1253.

［8］Appel M H，da Silveira R B，Chaim O M，et al.Identification，cloning and functional characterization of a novel dermonecrotic toxin(phospholipase D)from brown spider(Loxosceles intermedia)venom［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2008，(2):167 －178.

［9］Da Silveira R B，Pigozzo R B，Chaim O M，et al.Two novel dermonecrotic toxins LiRecDT4 and LiRecDT5 from brown spider(Loxosceles intermedia)venom:From cloning to functional characterization［J］.Biochimie，2007，(3):289 －300.

［10］Li M，Li L Y，Wu X，et al.Cloning and functional expression of a synthetic gene encoding huwentoxin—I，a neurotoxin from the Chinese bird spider(Selenocosmia huwena)［J］.Toxicon，2000，(2):153－162.

［11］刘君梁.虎纹捕鸟蛛毒素基因的克隆、表达及结构与功能关系的研究［D］.长沙:湖南师范大学硕士学位论文，2004.

［12］Park S P，Kim B M，Koo J Y，et al.A tarantula spider toxin，GsMTx4，reduces mechanical and neuropathic pain［J］.Pain，2008，(1):208 －217.

［13］Fitches E，Edwards M G，Mee C，et al.Fusion proteins containing insect－specific toxins as pest control agents:Snowdrop lectin delivers fused insecticidal spider venom toxin to insect haemolymph following oral ingestion［J］.Journal of Insect Physiology，50，(1):61－71.

［14］Down R E，Fitches E C，Wiles D P，et al.Insecticidal spider venom toxin fused to snowdropm iectin is toxic to the peach－potato aphid，Myzus persicae(Hemiptera:Aphididae)and the rice brown planthopper，Nilaparvata lugens(Hemiptera:Delphacidae) ［J］.Pest Management Science，2006，(1):77 －85.

［15］Nie D，Li M，Xu H.，et al Expression and purification of recombinant huwentoxin—I in Pichia pastoris［J］.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，2002，(2):172 －177.

［16］Peng K，Lin Y，Liang S.Nuclear magnetic resonance studies on huwentoxin－XI from the Chinese bird spider Ornithoctonus huwena:15N labeling and sequence－specific 1H，15N nuclear magnetic resonance assignments［J］.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2006，(7):457－466.

［17］Volynski K E，Nosyreva E D，Ushkaryov Y A，et al.Functional expression of alpha－ latrotoxin in baculovirus system［J］.FEBS Letters，1999，(1):25 －28.

［18］Ji W，Zhang X，Hu H，et al.Expression and purification of Huwentoxin－I in baculovirus system［J］.Protein Expression and Purification，2005，(2):454 －458.

［19］Khan S A，Zafar Y，Bfiddon R W，et al.Spider venom toxin protects plants from insect attack［J］.Transgenic Research，2006，(3):349－357.

Q51

A

1008－4681(2012)02－0032－03

2012－01－05

国家自然科学基金(批准号:30971432)资助项目;国家973项目(批准号:2010CB529800).

王浩(1987－)，男，江苏泰州人，国防科学技术大学理学院硕士生.研究方向:生物医学工程;刘燕波(1987－)，男，湖南新华人，湖南师范大学生命科学学院硕士生.研究方向:生物化学、分子生物学.* 并列第一作者.

(作者本人校对)