微纳米级微塑料及其添加剂复合效益对蓝藻的生长及叶绿素荧光的影响

马 欠，郭锋锋，邓 敏，刘 燕，赵 菊，晁江琴，沈 波

(昭通学院 地理科学与旅游学院，云南 昭通 657000)

自20世纪50年代以来，塑料制品由于在日常生活和商业活动中的广泛用途，已成为人类活动不可或缺的一部分。1970年代，美国国家科学院估计每年流入世界海洋的塑料通量为4.5万吨，相当于全球塑料产量的0.1%，2010年全球塑料的年产量已达2.65亿吨。人们对海洋中当前塑料存储量的估计是1970年代对释放到开放海洋中的漂浮塑料的保守一阶估计的100倍[1]。

进入环境中的塑料会逐渐破碎，最终形成更小的碎片，粒径小于5mm的塑料碎片和颗粒称为微塑料[2]。塑料及其相关的化学同源物进入陆地和水生栖息地，环境中微塑料的存在已在水生和陆地生态系统中得到广泛应对和证实[3]。现有研究中发现微塑料的存在对整个生态系统构成了巨大的威胁，对海洋、湖泊、河流、沿海地区甚至极地地区都产生了巨大的影响[4]。有学者发现塑料会破碎成微纳米级微塑料，研究微纳米级微塑料成为国际国内的趋势[5-6]。

浮游生物作为水中食物链的最基础一环，对于水生态系统功能维系具有关键作用[7-8]，浮游植物是水生生物的物质基础[9]。叶绿素荧光分析技术以光合作用理论为基础，利用体内叶绿素为天然探针，研究各种植物光合生理状况及外界因子对其影响的活体测定和诊断技术。叶绿素荧光动力学技术是用于评鉴作物耐受逆境能力的一项热门技术，被称为测定环境胁迫下响应快速、无损伤的探针[10]。1931年，德国Hirsch和Kautsky发现，绿色植物的叶片、藻液等经过暗适应一段时间后，经可见光照射，绿色植物叶片或藻类会发出微弱的暗红色的荧光信号，荧光信号的强弱随时发生变化，这个变化过程也称为叶绿素荧光动力学，即Kautsky效应[11]。

对于叶绿素荧光，多数文献主要是对光响应曲线(OJIP)中Fv/Fm这一指标进行解读，并未充分考虑能量分配比率和反应中心比活性参数[12-13]。以微纳米微塑料及其添加剂对藻的生长及叶绿素荧光的影响为主要研究对象，结合相关研究，重点研究微纳米级微塑料对蓝藻的生长及其叶绿素荧光的影响。此外，考虑到现实环境中塑料材质基本上添加有多种添加剂，因此也对具有多种添加剂的不同微纳米级微塑料对藻的生长及其叶绿素荧光进行研究。通过对微塑料材质进行萃取，检测塑料添加剂。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用的藻种为集胞藻，购自中国科学院武汉水生生物研究所，营养液选用BG-11培养。

1.2 实验方法

1.2.1 集胞藻的培养和实验过程

采用BG-11培养基进行培养，预选藻种为集胞藻作为受试藻。配置5L培养基作为调试藻密度的营养液，所有玻璃器皿都经过灭菌锅消毒处理。初始藻的密度控制为0.11(以吸光度表示)，选用3种微塑料尺寸分别为200μm,300μm和5mm。为了验证微塑料尺寸绝大多数处于该尺寸，使用体式显微镜做粒径分析，设置进入藻液的微塑料最终浓度为5mg/L和250mg/L。研究不同浓度对藻的影响，微塑料浓度分别设置为0，0.5，5，10，25，50mg/L，每组设置3个平行样。测定时间为1，12，24，48，96h。每天摇晃锥形瓶3～5次，然后取样测定藻的吸光度、叶绿素a、光响应曲线(OJIP)。

1.2.2 各参数的测定

(1)微塑料添加剂的测定

取非纯及纯的微塑料1g,倒入带玻璃盖的小试管中，然后加入乙腈饱和正己烷10mL。超声1h，然后静止12h，过0.22μm的有机相滤膜。放入棕色测样瓶，待测。设置气相进样口温度为250℃，初始温度为80℃。升温至280℃，保持15min。设置质谱扫描范围45～450，与气相运行时间一致。通过匹配库进行塑料添加剂的判断。针对增塑剂类选择离子峰149作为判定邻苯二甲酸酯的判断峰。

(2)OD值的测定

被检测物吸收的光密度，也称为吸光度，检测单位用OD值表示。实验开始后在规定时间取样1次，吸取2.5mL于比色皿中，紫外分光光度计测量其OD值，空白校准用BG-11营养液。

(3)叶绿素荧光参数的测定

取2.5mL藻液放入比色皿中，暗适应5min后，用叶绿素荧光仪(FL3500,PSI,捷克)直接测得。

1.3 数据处理分析

应用SPSS20.0软件对数据进行分析，用origin8.0绘图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度和尺寸纯微塑料共同胁迫对集胞藻生长及叶绿素荧光的影响

不同尺寸纯微塑料对集胞藻OD值的影响见图1。微塑料粒径分别为200um,350um和5mm，浓度设置为50mg/L和250mg/L。从图1中可以看出，不同尺寸对吸光度值的影响较小，微塑料浓度为250mg/L和粒径为200um时的OD值相对较低，空白组以及藻液微塑料浓度250mg/L和粒径5mm组的OD值相对较高。说明粒径的大小对微藻生长有一定的影响，当微塑料浓度相同时，微塑料粒径越小对微藻生长的胁迫作用越明显。72h测得微塑料浓度-粒径分别为50mg/L-200um，50mg/L-350um，250mg/L-200um，250mg/L-350um，250mg/L-5mm时，微藻OD值分别为0.42，0.41，0.41，0.42，0.42。OD值相对较低的两个组为50mg/L-350um和250mg/L-200um组，说明微塑料浓度对微藻生长影响较小，微塑料粒径越小对微藻生长的抑制作用越明显。

图1 不同尺寸微塑料集胞藻OD值的影响

不同尺寸纯微塑料对集胞藻叶绿素荧光值(Fv/Fm)的影响见图2。

图2 不同尺寸微塑料集胞藻Fv/Fm的影响

72h前，Fv/Fm值相对较低的组是微塑料浓度和粒径为250mg/L-200um组，在相同的浓度条件下，粒径最小的组Fv/Fm最低。微塑料粒径相同时，不同微塑料浓度下Fv/Fm变化不明显。50mg/L-200um组与250mg/L-200um组相比较，在相同的微塑料粒径胁迫下，250mg/L-200um组微藻Fv/Fm比50mg/L-200um组相应变低，说明高浓度微塑料对微藻生长产生一定的抑制作用。对比250mg/L-200um，250mg/L-350um和250mg/L-5mm组，Fv/Fm值最低的是250mg/L-200um组，在同样的微塑料浓度条件下，微塑料粒径越小，对微藻生长的抑制作用越明显。从6组数据可以看出，Fv/Fm最低的是250mg/L-200um组，即微塑料浓度最高和粒径最小组，说明微塑料高浓度低粒径对微藻生长的抑制作用最明显。

2.2 不同浓度纯微塑料对集胞藻吸光度值(OD680 )的影响

分别在装有藻液的三角瓶中添加增塑剂DEHP。DEHP为无色无臭液体，不溶于水，溶于乙醚、乙醇、矿物油等，由辛醇或异辛醇(2-EH)和邻苯二甲酸制成。将DEHP浓度分别设置为0，0.5，5，10，25，50mg/L，测微藻OD值的变化，判断不同浓度微塑料对微藻生长的影响。从图3中可以看出， 微藻OD值增长最快的为空白组，增长最慢的为增塑剂浓度设置为25mg/L组和50mg/L组，两组高浓度增塑剂对微藻生长产生一定的抑制作用。通过分析可知，96h时，增塑剂浓度为0.5，5，10，25，50mg/L组的OD值分别比空白组减少了4.44%，8.19%，1.87%，17.36%，18.54%。50mg/L组OD值减少量最高。由此可知，微塑料对微藻的生长产生一定影响，且浓度越高对微藻生长的抑制作用越明显。

图3 不同浓度微塑料集胞藻OD680的影响

不同浓度DEHP对集胞藻叶绿素荧光值(Fv/Fm)的影响见图4，DEHP浓度分别为0，0.5，5，10，25，50mg/L的6个组中，Fv/Fm下降最不明显的组是空白组，没有添加增塑剂；下降最明显的组是DEHP浓度为25mg/L和50mg/L组，说明DEHP浓度为25mg/L和50mg/L时对集胞藻的生长产生抑制作用。除了空白组Fv/Fm缓慢上升外，其他浓度组都以不同程度下降，浓度越高下降越明显，说明微塑料浓度越高对微藻生长的抑制作用越明显。

图4 不同浓度微塑料集胞藻Fv/Fm的影响

不同浓度微塑料对集胞藻叶绿素a的影响见图5。从图5中可以看出DEHP浓度分别为0，0.5，5，10，25，50mg/L的几个组叶绿素a的变化趋势不明显，只有浓度最高组在24h和120h为最低值，其他浓度组变化不明显。说明微塑料需要达到较高浓度，对微藻叶绿素a才能产生影响。

3 讨论

自20世纪50年代大规模生产塑料以来，塑料产量每年逐渐接近3亿吨。估计到2050年，塑料产量会增加至330亿吨。塑料产量增加的同时，塑料垃圾的排放量也在日益增加，并且通过偶然的排放和不加区分的丢弃物的随意处置，塑料垃圾在环境中以无法控制的速度累积。在自然环境下，这些塑料垃圾由于物理、化学及生物活动可以慢慢降解为极小的颗粒，分散、汇聚在海洋、湖泊、河口、河底及生物体中，甚至有可能被迁移到地下系统中。有学者研究这种尺寸较小的塑料碎片(微塑料)沉积体和一些浮游生物的比例相同，它们可能对广泛的生物体具有生物可利用性，在一定程度上会带来一些不利的环境效应。

图5 不同尺寸浓度微塑料集胞藻叶绿素a的影响

设置不同的微塑料浓度和不同的微塑料粒径，在固定的时段测量微藻的OD值、叶绿素荧光值、叶绿素a，通过测量可知，微塑料粒径大小和不同浓度均会对微藻的生长产生一定的影响，当浓度一定时，微塑料粒径越小对微藻生长的抑制作用就越明显，当粒径大小一定时微塑料浓度越高对微藻生长的抑制作用越明显。在浓度和粒径共同胁迫实验组中，集胞藻生长明显变缓，说明集胞藻生长受到抑制，在浓度组实验中，当微塑料浓度大于10mg/L时，浓度越高集胞藻生长受到的抑制作用就越明显。