蒺藜皂甙的提取及部分纯化研究

宋彦显，闵玉涛

(中州大学化工食品学院，郑州450044)

中药蒺藜，别名刺蒺藜、硬蒺藜、白蒺藜，有活血祛风、平肝解郁、明目、止痒等功效。［1，2］蒺藜的主要生理活性成分为皂甙，有明显的强壮及抗动脉硬化作用。苏联及保加利亚用其总皂甙制剂治疗动脉硬化及提高性功能;我国用其全草开发了相应制剂“心脑舒通”，在防治心脑血管疾病与性功能减退症方面显示良好疗效。［3，4］鉴于蒺藜皂甙在健身、抗疲劳方面的突出作用，它有望成为功能因子研究领域中的一颗新星。本实验在前人工作的基础上对蒺藜皂甙的提取、分离、部分纯化的工艺条件进行了系统研究，以期为医药和食品工业中新型功能因子的研究与开发提供可靠的实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

蒺藜，购于郑州中药城，经专职药剂师鉴定;LSA-20大孔树脂，西安电力树脂厂。

SP-2102PC型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司;HH-S11-2型电热恒温水浴锅，北京长安科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 蒺藜皂甙的提取及分离

1.2.1.1 水提醇沉法

取粉碎至40目的蒺藜40g，加蒸馏水(固液比1∶10，W/V)回流提取3h，趁热过滤，真空浓缩，以蒸馏水定容至 50mL，搅拌下缓慢加入95%乙醇425ml，滤去沉淀，真空浓缩至近干，硅藻土转移，滤纸包裹，依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯索氏提取1h，再用正丁醇索氏提取3h。各提取组分分别浓缩，风干，称重，计算各部分收率。做定性试验。

1.2.1.2 70%乙醇回流提取法

取粉碎至40目的蒺藜40g，70%乙醇(固液比1∶10，W/V)回流提取3h，趁热抽滤，滤液真空浓缩至近干，浸膏硅藻土转移，滤纸包裹，依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯索氏提取1h，再用正丁醇索氏提取3h，各提取组分分别浓缩，风干，称重，计算各部分收率。做定性试验。

1.2.2 大孔吸附树脂部分纯化

将未使用过的大孔树脂用乙醇浸泡一天活化，装柱(柱内径2.6cm)，填料高度 18.1cm。用1%的NaOH约两个床体洗涤，然后用1%的HCl洗涤。蒸馏水冲洗至中性，待用。

洗脱所用水及乙醇液体积可按床体的倍数添加，便于计算所需洗脱液体积。

正丁醇相浓缩至干，少量水溶，上柱，依次用蒸馏水和 20%，30%，40%，50%，55%，60%，65%，75%，80%，95%乙醇梯度洗脱，收集各组分，进行泡沫实验和颜色反应。将 40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脱液烘干称重。

1.3 产物表征［5］

1.3.1 定性实验

1.3.1.1 泡沫实验

取样品水溶液2mL于小试管中，用力振摇1min，如产生多量泡沫，放置15min后泡沫减少不明显，则证明含皂甙。另各取样液1mL，一管加2mL 0.1MNaOH 溶液，另一管加2mL 0.1MHCl溶液，用力振摇1min，泡沫高度相近是三萜皂甙，加碱管明显高于加酸管的是甾体皂甙。

1.3.1.2 显色反应

(1)醋酐-浓硫酸反应

取少量皂甙样品溶解于醋酐中，加入醋酐-浓硫酸试剂，能产生颜色变化，一般由黄色转为红色、紫色、蓝色或绿色。如果是甾体皂甙，在颜色的变化中最后呈现绿色，而三萜皂甙只能转变为红色、紫色或蓝色，不出现绿色。

(2)三氯乙酸反应

甾体皂甙滴在纸上，滴三氯乙酸试剂，加热至60℃，生成红色渐变为紫色。同样情况下，三萜皂甙必须加热到100℃才显色，也生成红色渐转为紫色。

(3)氯仿-浓硫酸反应

少量皂甙样品溶解于氯仿，加入浓硫酸后，在氯仿层呈现红色或蓝色，硫酸层有绿色荧光出现。

(4)冰醋酸-乙酰氯反应

少量皂甙样品溶解于冰醋酸中，加入乙酰氯数滴及氯化锌结晶数粒，稍加热，则呈现淡红色或紫红色。

(5)三氯化锑反应

样品醇溶液点于滤纸上，喷20%三氯化锑氯仿溶液(不含乙醇或水)，于60～70℃加热，样品斑点呈灰蓝﹑蓝﹑灰紫等颜色。

1.3.1.3 其它物质定性检验

(1)黄酮定性实验(盐酸-镁粉反应)

样品溶解于甲醇或乙醇，加入少量镁粉振摇，滴加几滴浓盐酸，1～2min内(必要时微热)即可出现颜色。多数显红色～紫红色，少数显紫色～蓝色。

(2)鞣质定性实验(三氯化铁反应)

样品液中滴入三氯化铁溶液，缩合鞣质呈绿色或绿黑色或沉淀，可水解鞣质呈蓝色或蓝黑色并多有沉淀。

(3)糖类检测(α-萘酚反应)

取样液约1mL，加入α-萘酚试剂3滴，混匀，沿管壁慢慢加入浓硫酸约1mL，小心竖起试管，使硫酸与样液清楚地分为两层。两液面间有紫色环，说明样液中含糖。

1.3.2 薄层层析

以硅胶制成的分析板为固定相，以展开剂作为展开体系进行薄层层析。用毛细管取样液点样，点样原点距底边约0.8cm，原点线距展开前沿线约为6cm。在原点线上确定两个点为点样位置，边点样边用吹风机吹溶剂，防止样点扩散。吹干后将硅胶板置于已加入展开剂的层析缸中展开，待展开至前沿线取出，再次吹干后放入碘盒中碘熏显色，约2 min后取出，观察分离情况。

1.3.3 紫外可见分光光度法

1.3.3.1 比色

0.0045g皂甙溶于40mL 80%甲醇液中(样品浓度为0.112mg/mL)，分别移取 0mL，0.4mL，0.8mL，1.2mL，1.6mL，2.0mL 于试管中，各加 2.0mL 0.5%香草醛乙醇溶液、1.0mL72%硫酸溶液，加80%甲醇至6mL，波长544nm处测吸光度。

1.3.3.2 紫外扫描

(1)大孔树脂分离纯化的蒺藜皂甙用无水乙醇溶，分别取 50μL，60μL，70μL，80μL，90μL 在 200 ～360nm范围内进行扫描，以乙醇做空白。

2 结果与讨论

2.1 蒺藜皂甙的提取与初步分离研究

2.1.1 皂甙粗提方法的选择

蒺藜中的主要化学成分有甾体皂甙、生物碱、黄酮、氨基酸等物质。多数皂甙极性较大，一般可溶于水，易溶于热水、稀醇，难溶于丙酮，几乎不溶于石油醚、苯、乙醚等亲脂性溶剂。

表1 水提醇沉法和70%乙醇法提取后样品的收率(%)

石油醚和乙醚是亲脂性有机溶剂，极性较小，只能溶解一些极性小的亲脂性物质，如脂溶性色素、油脂和蜡。乙醚可以溶解经甲醇醇解作用得到的低分子酚类物质，这一类型的天然物质在蒺藜中所占的比例很小。乙酸乙酯的极性较大，除了溶解前两者不溶的脂溶性物质外，还可溶解黄酮类、蒽醌类物质。正丁醇极性更大，对组织细胞的穿透力更强，皂甙类主要可能在这一组分发现，此外，还可溶解单宁及其它高极性杂质。

由表1可看出，梯度提取中，其收率顺序为:正丁醇＞乙酸乙酯＞乙醚＞石油醚。

通过比较两种方法所得粗皂甙重量及收率，可知70%乙醇回流法所得皂甙量和收率均高于水提醇沉法，是较优的提取方法。因为水提法在醇沉这一步骤时，将部分皂甙也夹带沉淀，造成损失。

2.1.2 初步提取分离中的定性检测

对1.2.1.1索氏提取的各样品做定性检验，结果见表2。

表2 水提醇沉法所得样品定性检测结果

试验结果表明，正丁醇组分三种定性反应都呈阳性，说明其中存在皂甙。乙醚和乙酸乙酯组分冰醋酸-乙酰氯反应现象呈阴性，醋酐-浓硫酸、氯仿-浓硫酸反应现象虽然呈阳性，但不如正丁醇组分明显，说明乙醚相、乙酸乙酯相中也溶有少量皂甙。石油醚组分的定性反应现象都呈阴性，表明皂甙在石油醚中几乎不溶解。

对70%乙醇回流提取的样品进行定性检测，得出的结果与水提醇沉的样品相似。

另外，对各组分进行盐酸-镁粉反应及三氯化铁反应定性检测。检测结果:盐酸-镁粉反应，乙酸乙酯组分明显呈阳性，说明乙酸乙酯相中含较多黄酮，其它各相呈阴性，说明各相中不含黄酮或含极少量黄酮;三氯化铁反应，各相均呈阳性(三氯化铁层呈绿色)，表明各相含酚类物质，只是含量有差别。

2.1.3 薄层分离

取索氏提取后的各相液体少量，用薄层层析板进行分离分析。

乙醚相:展开体系为氯仿-丙酮-甲醇，8∶2∶1，碘蒸气熏显色后，可显出三个斑点。

乙酸乙酯相:展开体系为氯仿-丙酮-甲醇，8∶2∶1，碘蒸气熏显色后，发现有单一的点，Rf=0.31;氯仿-乙酸乙酯 -乙酸，5∶5∶1，显示有三个点，Rf1=0.18，Rf2=0.41，Rf3=0.61。

正丁醇相:展开体系为乙酸乙酯-醋酸-水，8∶2∶1，点在原处，未跑开，因展开剂极性太低;展开体系氯仿 -甲醇 -水，3∶1.5∶0.5，拖尾现象严重，因其组分太多。

2.2 正丁醇组分大孔吸附树脂分离

2.2.1 各浓度洗脱液洗脱出的物质重量

将40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脱下的各组分定容至25mL，移液管取5mL于称量瓶中，烘干至恒重，称重，计算总物重。结果见表3。

表3 各浓度洗脱液洗脱出的物质重量(g)

固形物量的分布与洗脱液体积、流速及洗脱方式(梯度、平行)有密切关系。由表3可看出，随洗脱液浓度的增加，洗脱出固形物的量反而减小。因每个浓度洗脱液体积均为两个床体，在较低浓度时，皂甙已被分离出来。梯度洗脱时，此种现象必然发生。若为平行方式，相同体积洗脱液，高浓度洗脱出的物质量应多于低浓度。

2.2.2 定性检测

对蒸馏水、不同浓度的乙醇洗脱所得各个组分定性检验。

先用两个床体的蒸馏水洗脱，将其中的糖和蛋白质洗尽。跟踪检测，直到滴出的液体α-萘酚反应现象呈阴性，才可判定其中不含糖。

对20%，30%乙醇洗脱液做泡沫试验，由于成分复杂，即便有皂甙纯度也不高，无法得出肯定的结论。30%乙醇洗出的组分经盐酸-镁粉反应检测，显紫红色，表明了黄酮的存在。

取40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脱液分别做定性试验，发现均含皂甙。

80%，95%乙醇洗脱，皂甙定性试验呈阳性，但颜色较弱，显示含量偏低，估计是由于大部分皂甙已被洗脱出的缘故。

由此可断定40%乙醇洗脱液中皂甙含量最高。

2.2.3 薄层分析

将收集的经大孔树脂部分纯化过的皂甙样品进行薄层层析，展开体系为氯仿-甲醇-水，65∶35∶10，结果如图1所示。

图1 大孔树脂柱层析分离后的皂甙

从图1中可看出仅有一个斑点，Rf=0.86，可知蒺藜皂甙经大孔树脂柱层析后得到进一步纯化。

3 结论

(1)通过测皂甙得率与浓度，将水提醇沉法与70%乙醇回流法比较，证实70%乙醇回流法皂甙的得率较高，是较优的提取方法。

(2)经大孔树脂LSA-20纯化，皂甙主要存在于40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脱液中，浓缩得较纯的皂甙。用薄层分析证实皂甙得到了纯化。

［1］Conrada J，Dinchevb D，Klaibera I，et al.Anovel furostanol saponin from Tribulus terrestris of Bulgarian origin［J］.Fitoterapia，2004(75)：117-122.

［2］Combarieu E，Fuzzati N，Lovati M，et al.Furostanol saponins from Tribulus terrestris［J］.Fitoterapia，2003(74)：583-591.

［3］张健，李俊.蒺藜提取物的药理研究进展［J］.中医药研究，1989(6)：56-57.

［4］蔡利锋，景凤英，张建国，等.蒺藜化学成分的研究［J］.药学学报，1999，34(10)：759-761.

［5］北京医学院，北京中医学院编.中草药成分化学［M］.北京：人民卫生出版社，1980.