枣黑斑病菌绿色荧光蛋白标记菌株的构建

王廷松 王鹏程 郭俊玲 王 兰

(塔里木大学南疆农业有害生物综合治理重点实验室/新疆建设兵团南疆特色果树生产工程实验室/农业部阿拉尔作物有害生物科学观测实验站，新疆 阿拉尔 843300)

新疆南疆红枣种植面积较大，历史也比较久远。近几年来，新疆红枣枣果生产中红枣黑斑病发生极其严重，农户称这种病为“黑屁股病”。又称黑头病、黑腐病。这种病害多发生于骏枣品种上，是一类由真菌侵染所引起的病害,主要为害果实,导致果实果肉腐烂,不堪食用[1],病果率高达60%，造成严重的经济损失。研究结果表明，引起枣黑斑病的致病菌是链格孢菌，还有少数是茎点霉菌[2]。使用GA提高产量，降低其叶果比，果实营养不良免疫力下降是红枣黑斑病发生的重要内因[3]，8月份下旬多雨引起的果实酸碱不均衡是红枣黑斑病发生的重要原因；红枣成熟期多雨是黑斑病发生的必要条件。

参照张俊华等方法[4]，以新疆南疆枣园普遍发生的枣黑斑病为研究对象，以含有双元载体农杆菌为材料，介导枣黑斑病菌，获得最优的遗传转化体系，获得GFP标记的菌株。本次研究利用了ATMT技术，对链格孢菌Alternariaalternata进行了ATMT转化。最终获得了约200多个转化子。通过研究进行后期的致病力观察。为后期研究病原菌与枣的互作以及实时、动态观察病原菌在寄主体内的侵染过程奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

枣黑斑病菌：链格孢菌Alternariaalternata，由本课题组从新疆建设兵团第一师骏枣园中病果上分离培养而获得[2]。

根癌农杆菌：由石河子大学赵思峰教授实验室提供。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基:马铃薯200 g，葡萄糖15. 0 g，琼脂20. 0 g，加蒸馏水定容至1 000 ml。

PCA培养基：胰蛋白胨5. 0 g,酵母浸粉2. 5 g，葡萄糖1. 0 g,琼脂15. 0 g，加蒸馏水定容至1 000 ml。

LB培养基：胰蛋白胨10.0 g,酵母提取物5. 0 g，氯化钠5. 0 g，加蒸馏水定容至1 000 ml[3]。

AIM诱导培养基：K-Buffer10 ml,M-N-Buffer20 ml,氯化钙1 ml ,硫酸亚铁10 ml,Spore.element5 ml,硝酸铵5 ml，甘油(50%)10 ml,葡萄糖10 ml,加蒸馏水定容至1 000 ml。

1.1.3 抗生素

卡那霉素(100 μg· ml-1)、乙酰丁香酮(200 μmol·L-1)、潮霉素B(50 μg·ml-1)、头孢霉素(300 μg·ml-1)

1.1.4 仪器

纱布、滤纸、烧杯、三角瓶、培养皿、高压蒸汽灭菌箱、恒温培养箱 、石英比色皿、显微镜、血球板计数器、NC膜等。

1.2 方法步骤

1.2.1 农杆菌介导链格孢菌遗传转化体系的优化

活化枣黑斑病：参照链格孢菌苹果致病型ATMT转化方法[5]并适当调整。将PKO1-HPH质粒通过冻融法转化到农杆菌AGL1中，吸取微量的农杆菌涂布于含有100 μg· ml-1卡那霉素的LB固体培养基上于恒温培养箱内26 ℃培养48 h。

制备农杆菌液：挑取单菌落于10 ml的LB液体培养基(含100 μg·ml-1卡那霉素)中，28 ℃震荡(180 r/min)培养48 h,吸取100～500 μl培养液于20 ml含有200 μmol·L-1的AS(乙酰丁香酮，acetosyringone)、100 μg·ml-1卡那霉素的AIM液体培养基中，28 ℃震荡(180 r/min)培养 5～6 h ,OD600值达到0. 6时共培养。

枣黑斑病菌株转化：将Alternariaalternata菌株所产的孢子洗下，制成浓度分别为1. 0×104个/ml、1. 0×105个/ml、1. 0×106个/ml、1. 0×107个/ml、1. 0×108个/ml的悬浮液。分别取上述农杆菌液与孢子悬浮液各100 μl均匀混合，涂布于含有200 μmol·L-1AS和100 μg·ml-1卡那霉素的AIM平板上的硝酸纤维化膜(NC膜)表面，在25 ℃下黑暗共培养24 h、36 h、48 h、60 h、72 h。然后将NC膜转到含有50 μg·ml-1潮霉素B和300 μg·ml-1头孢霉素的PDA平板上4～7天。

转化体系的优化：对分生孢子悬浮液的浓度、农杆菌浓度、共培养时间、共培养温度等条件进行优化，筛选出枣黑斑病菌遗传转化的最佳体系。

农杆菌液浓度的优化：农杆菌浓度设置5个浓度梯度，分别是100 μl、200 μl、300 μl、400 μl、500 μl。分别测出OD值，选取OD值最接近0. 6的农杆菌液浓度。

孢子悬浮液浓度的优化：将菌株所产的孢子洗下，制成浓度分别为1. 0×104个/ml、1.0×105个/ml、1. 0×106个/ml、1. 0×107个/ml、1. 0×108个/ml的悬浮液。然后与浓度为400 μl的农杆菌液均匀混合，共培养。筛选出转化效率最佳的孢子悬浮液浓度。

共培养温度的优化:选取以上最佳农杆菌液浓度和最佳孢子悬浮液浓度，设置5个共培养温度分别为15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃共培养，筛选出转化效率最佳的共培养温度。

共培养时间的优化：选取以上最佳的共培养温度、农杆菌液浓度、孢子悬浮液浓度，设置5个共培养时间，分别为24 h、36 h、48 h、60 h、72 h。黑暗条件下共培养。筛选出转化效率最佳的共培养时间。

1.2.2 链格孢菌GFP标记菌株的构建

以农杆菌介导枣黑斑病菌最优的遗传转化体系为基础，对实验室保存黑斑病菌的孢子进行 GFP 标记。继代培养后，通过菌落形态，生长速度以及致病力测定筛选获出遗传稳定、与野生型黑斑病菌相比性状没有发生显著变化的GFP标记菌株。

2 结果与分析

2.1 农杆菌液浓度对转化效率的影响

农杆菌液的浓度不同，所测得OD值也是不同的，当农杆菌液浓度为0时，OD值也为0，随着农杆菌液浓度的增加，其OD值也随之增大，当浓度增大到500 μl时，OD值达到0. 815。当浓度为400 μl时，OD值为0. 605，此浓度的OD值最接近于0. 6，因此农杆菌浓度为400 μl最佳。(图1)

图1农杆菌液浓度的优化图2孢子悬浮液浓度的优化

2.2 孢子悬浮液浓度的优化

孢子悬浮液浓度对转化子转化效率也有影响，不同孢子浓度下得到的转化子量也存在较大差异。起始随着孢子悬浮液浓度增加，转化效率也开始增加。当浓度1. 6×106个/ml达到时，转化效率达到一个高峰。但再次随着浓度的增加，转化效率开始下降。因此1. 6×106个/ml是最适宜的孢子悬浮液浓度。(图2)

2.3 共培养温度的优化

转化效率与共培养温度也有关系，随着温度的升高，转化效率也增加。当温度达到25 ℃时，转化效率最好，然后随着温度上升，转化效率下降。随着温度升高转化效率下降，其原因是，温度过高，导致孢子活性丧失。所以25 ℃时最适宜的共培养温度。(图3)

图3 共培养温度的优化

2.4 共培养时间的优化

不同共培养时间条件下的转化效率存在一定的差异，培养时间小于12 h时，转化效率最差。随着时间的增加，转化效率也增加，当达到60 h时，转化效率最佳，随后随时间的增加而下降。故共培养时间为60 h时，转化效率最佳。(图4)

图4 共培养时间的优化

2.5 链格孢菌GFP标记菌株的构建

农杆菌介导枣黑斑病菌最优的遗传转化体系，继代培养，获得具有GFP标记的菌株，菌株转化子培养后的菌落形态见图5、图 6 。在遗传体系转化过程中已获得黑斑病菌孢子的转化子并获得GFP标记菌株，其荧光显微形态图见图7。

a.共培养24 h b.共培养36 h图5 菌株共培养菌落形态图

c.转化第3 d d.转化第4 d

e.纯培养第2 d f.纯培养第3 d

g.带荧光标记 h.无荧光标记

i.转化子侵染枣果后的显微观察 j.发病骏枣枣果石蜡切片显微观察

图7荧光显微形态图

3 小结与讨论

从BunDock等[6]把根癌农杆菌介导的转化技术运用于真菌以来，现已经在很多种真菌、细菌上应用成功[7]。农杆菌介导的遗传转化体系的方法是一种优秀的转化方法，具有转化效率高、转化子稳定等特点。农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，大多数双子叶植物的受伤部位都可以被其感染[8]。在链格孢菌中顾雪迎等利用ATMT介导[9]技术完成了链格孢菌苹果致病型的转化体系。

链格孢菌是半知菌类真菌，属于丝状真菌，能够引起多种经济作物的病害。比如，苹果黑斑病、小麦叶枯病、玉米大斑病、白菜黑斑病和红枣黑斑病等等。链格孢菌大量存在于土壤、空气和一些有机质中。

在本研究中，对分生孢子悬浮液的浓度、农杆菌浓度、共培养时间、共培养温度[10]等条件进行优化，筛选出最佳的转化体系，获得稳定的转化子。最终得到农杆菌浓度为400 μl，OD值为0. 605；孢子悬浮液浓度为1. 0×106个/ml，转化效率最佳；共培养温度为25 ℃，转化效率最佳；共培养时间为60 h，转化效率最佳；这个转化体系最优，转化子的转化效率最佳，获得了最佳的转化子和GFP标记的菌株。本研究为下一步链格孢菌致病性的研究打下了基础。