大枣多糖硒铁复合物的合成工艺研究

丁慧萍 高玉林 洪远新 吴 瑛 张 娜

(塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)



大枣多糖硒铁复合物的合成工艺研究

丁慧萍 高玉林 洪远新 吴 瑛 张 娜*

(塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)

根据有机硒化合物及有机铁化合物的合成原理研究了大枣多糖硒复合物加铁的合成工艺。利用单因素试验和正交试验，研究了反应温度、催化剂用量、三氯化铁的量及溶剂的量对大枣多糖硒加铁效果的影响。实验结果显示最佳合成工艺条件为反应温度70 ℃、提取时间5h、三氯化铁加入量0. 2g、溶剂的量70mL。在此条件下，多糖硒铁复合物中硒和铁的含量分别为3. 414mg/g和12. 04mg/g。紫外光谱数据显示多糖与硒(Ⅳ)和铁(Ⅲ)先后发生了反应，红外光谱显示多糖硒铁中含有C-Se=O键和Se-H键，铁以γ-FeOOH结构聚合成铁核。

大枣多糖硒铁； 复合物； 正交试验； 结构表征

硒作为人体不可或缺的微量元素之一，与人体的健康息息相关，具有清除自由基、保护细胞、拮抗毒性、提高人体免疫功能、保护骨髓造血功能及潜在的抗癌、防衰老等多种作用[1]。铁是血红蛋白的重要组成部分，是体内物质氧化供能过程中所需多种化合物的重要组成成分，是维持人体正常生理功能不可或缺的元素，体内缺铁或铁吸收不良时，就会引起缺铁性贫血、影响婴儿行为和智力的发育、免疫力和抗感染能力下降等多种疾病[2-3]。大枣多糖是大枣中重要的生物活性物质，能够清除自由基、增强免疫功能、抗脂质过氧化反应，提高机体免疫能力，且对正常细胞无毒副作用，是理想的免疫增强剂[4-5]。

由于大枣多糖本身具有多种生物活性，与金属离子结合能给机体提供安全无毒的微量元素，同时也能发挥大枣多糖自身的药用价值，使之具有更强的生物活性，因此对多糖的分子修饰和结构改造具有重要的意义[3]。目前将多糖与硒有机结合成为硒多糖，国内外的研究尚处于起步阶段，获得了一些人工合成的硒多糖和天然硒多糖，如灵芝硒多糖、香菇硒多糖、螺旋藻硒多糖、箬叶硒多糖和大蒜硒多糖等[6]。同时多糖铁复合物的研究也有一定的进展，国内文献报道了多种多糖铁的制备，化橘红多糖铁(III)配合物[7]、银耳多糖铁(III)配合物[8-9]、当归多糖铁(III)配合物[10]、地黄多糖铁(III)配合物[11]、南瓜多糖铁(III)配合物[12]、紫菜多糖铁(III)配合物[13]、白芍多糖铁(III)配合物[14]都有望作为新的生物利用度较高的补铁剂。但是关于将大枣多糖与硒、铁元素合成为大枣多糖硒铁复合物的研究尚未见报道。

1 实验材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

材料：新疆大枣(购于阿拉尔市九团农贸市场)洗净、置于阴凉通风处自然晾晒2-3月，风干后去核，用粉碎机打磨成粉，备用。

试剂：亚硒酸钠、抗坏血酸、无水乙醇、甲苯、邻苯二胺、硫酸亚铁铵、邻菲啰啉、三氯化铁、硫氰化钾、高氯酸、柠檬酸钠等，均为分析纯。

仪器：DZF-6053真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；SHZ-D循环水式真空泵(上海东玺制冷仪器设备有限公司)；FA1004N电子天平(上海菁海仪器有限公司)；FE200样品粉碎机(北京永光明)；DF-101S集热式磁力加热搅拌器(江苏省金坛市医疗仪器厂)；FTIR-8400S紫外分光光度计(日本岛津)；旋转蒸发器RE-5299(上海予华仪器有限公司)；FTIR-8400S傅立叶变换红外光谱仪(日本岛津)。

1.2 实验方法

1.2.1 大枣多糖的提取

精确称量100 g去核枣粉，加水800 mL，80 ℃温度下水浴搅拌浸提3 h，抽滤，残渣用水反复提取两次，合并三次所得多糖提取液，提取液45 ℃减压浓缩，用无水乙醇沉淀粗多糖，抽滤，得粗多糖沉淀，粗多糖加水溶解后，氯仿正丁醇脱蛋白，所得大枣多糖液用NaOH溶液调pH值至弱碱性，加0. 4倍多糖液体积的双氧水水浴保温4 h脱色，无水乙醇沉淀，抽滤，沉淀用无水乙醇洗涤，45 ℃真空干燥，得大枣多糖。

1.2.2 大枣多糖硒的合成

精确称量0. 20 g大枣多糖放入250 mL锥形瓶中，加入20 mL的0. 75%硝酸溶液，加热搅拌使其全部溶解，得10 mg/mL的多糖溶液, 再向锥形瓶中加入0. 2 g亚硒酸钠，在70℃水浴加热搅拌，反应5 h后，待反应液冷却，抽滤除去沉淀，滤液装入透析袋中用流水透析过夜，然后取少量(1～2 d)透析液加入抗坏血酸检测，至无红色时停止透析，然后减压蒸馏至稠膏状(5～10 mL)，用无水乙醇沉淀，在冰箱中放置过夜，抽滤后沉淀用无水乙醇洗涤，真空干燥，得多糖硒。

1.2.3 大枣多糖硒铁的合成

取0. 20 g按最佳多糖硒的合成工艺合成出的大枣多糖硒，将其加入到250 mL的锥形瓶中，并加入柠檬酸三钠0. 05 g，用70 mL的蒸馏水溶解，在70℃水浴中不停搅拌10 min，缓慢滴加1 mol/L的三氯化铁溶液6 mL，滴加完毕继续在热水浴中搅拌1. 5 h，趁热过滤，收集滤液，减压蒸馏至20 mL，用流水透析至溶液加KSCN无血红色为止，减压蒸馏至稠膏状(5～10 mL)，醇沉，并静置过夜，使沉淀完全，过滤，真空干燥，得大枣多糖硒铁复合物。

1.2.4 硒标准曲线的绘制

取2 μg/mL硒溶液0. 00、1. 25、2. 50、5. 00、10. 00、15. 00、20. 00、25. 00 mL，分别置于125 mL分液漏斗中，加水30 mL，用稀盐酸溶液调pH = 2，加1%邻苯二胺盐酸盐试液3. 0 mL，摇匀，放置2 h，然后加甲苯10. 00 mL，萃取、静置，分取甲苯层，以0 mL不含硒溶液为空白对照液，在紫外分光光度计190～800 nm范围内做光谱扫描，确定最大吸收波长为334 nm。于最大吸收波长处测定吸光度值A，以含硒量(微克数)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程。

1.2.5 铁标准曲线的绘制

量取铁(II)标准溶液0. 01 mg/mL置于50 mL容量瓶中，加入10%抗坏血酸溶液2. 50 mL，邻菲啰啉显色液5. 00 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，标准铁溶液放置在40℃的水浴锅中恒温20 min，用紫外-可见分光光度计在190～800 nm处以蒸馏水为空白进行扫描。确定出最大吸收波长为510 nm。准确吸取含铁(II)0. 01 mg/mL 标准工作溶液0. 00 mL、1. 00 mL、2. 00 mL、4. 00 mL、6. 00 mL、8. 00 mL、10. 00 mL，依次加入到50 mL 容量瓶中，再分别一次加入10%抗坏血酸溶液2. 50 mL，邻菲啰啉溶液5. 00 mL，用蒸馏水定容，摇匀。保持此反应液在37℃恒温20 min，以0. 00 mL铁标液为空白，于最大吸收波长处测定吸光度值A，以含铁量(毫克数)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程。

1.2.6 样品中硒、铁含量的测定

取大枣多糖硒铁样品0. 02 g，研碎后放入100 mL锥形瓶中，加入4 mL混和酸(HClO4∶H2 SO4∶HNO3=1∶1∶4)浸渍，放置过夜。然后将锥形瓶于恒温水浴锅中，在95℃下静置约1. 5 h，然后均分为两份：一份转入分液漏斗中，按硒标准曲线的绘制中的方法进行处理，以334 nm为检测波长，测定吸光度值，根据回归方程计算样品中硒含量；另一份转入50 mL的容量瓶中，然后按照铁标准曲线的绘制中的方法进行处理，以510 nm为检测波长，测定吸光度值，根据回归方程计算样品中铁含量。

1.3 正交试验设计

为了得到最佳的制备工艺，本实验选取柠檬酸钠、三氯化铁、反应温度和溶剂的量共四个因素进行单因素试验，在单因素试验的基础上确定正交试验的因素和水平(见表1)，按L9(34)正交表进行正交试验确定最佳制备工艺条件。

表1 试验因素及水平

1.4 大枣多糖硒铁复合物的结构表征

分别称取适量的多糖、多糖硒、多糖硒铁于50 mL容量瓶加蒸馏水配置成溶液，然后在200～400 nm波长下进行紫外(UV)光谱扫描。

采用KBr压片法通过傅里叶变换红外光谱仪分别测定多糖、多糖硒及多糖硒铁的红外光谱。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

2.1.1 硒的标准曲线

图1 硒的标准曲线

如图1所示，硒的标准曲线的线性回归方程为y = 0. 019 2 x - 0. 012 2，其相关系数为1。

2.1.2 铁的标准曲线

图2 铁的标准曲线

如图2所示，铁的标准曲线的线性回归方程为y = 3. 955 3 x - 0. 003 5 ，其相关系数为0. 999 6。式中y为铁的吸光度，x为铁的质量。

2.2 单因素试验

2.2.1 柠檬酸三钠对制备效果的影响

在溶剂量70 mL、反应温度80 ℃、三氯化铁6 mL，柠檬酸三钠的加入量分别为0. 01 g、0. 05 g、0. 10 g、0. 15 g的条件下实验结果如图3所示。

由图3可以看出，铁含量随着柠檬酸三钠的加入先迅速增大后又急剧减小，之后趋于平稳，当加入量至0. 05 g时含量达最高。

图3 柠檬酸三钠对铁含量的影响

2.2.2 三氯化铁的量对制备效果的影响

在柠檬酸三钠0. 05 g、溶剂量70 mL、反应温度80℃，三氯化铁溶液加入量分别为4 mL、6 mL、8 mL、10 mL的条件下实验结果如图4所示。

图4 三氯化铁对铁含量的影响

由图4可以看出，随着1 mol/L的三氯化铁溶液加入量的增大铁含量先迅速增大后又缓慢减小，当加入量为6 mL时铁含量达到最大。

2.2.3 反应温度对制备效果的影响

在柠檬酸三钠0. 05 g、溶剂量70 mL、三氯化铁6 mL，反应温度分别为60℃、70℃、80℃、90℃的条件下实验结果如图5所示。

图5 反应温度对铁含量的影响

由图5可以看出，在60 ℃～70 ℃时铁含量稍有增加，在80 ℃时铁含量达到最高，之后含量又急剧减小。

2.2.4 溶剂的量对制备效果的影响

在柠檬酸三钠0. 05 g、三氯化铁6 mL、反应温度80 ℃，溶剂的量分别为60 mL、70 mL、80 mL、90 mL的条件下实验结果如图6所示。

由图6可以看出，随着溶剂量的增大，铁含量先迅速增大，在70 mL时含量达最高，之后又迅速减小。

2.3 大枣多糖硒铁的最佳工艺条件

由表2正交试验结果极差和方差分析可知，影响大枣多糖硒铁中铁含量的各因素的主次顺序为三氯化铁>柠檬酸三钠>反应温度>溶剂的量，其中三氯化铁的影响最为显著。试验表明，提取工艺的最佳条件为A1B2C2D2，即柠檬酸三钠加入量0. 02 g、三氯化铁6 mL、反应温度80 ℃、溶剂的量70 mL。

按照正交试验所得的工艺进行验证，做3次平行试验，与正交表中数据基本符合，此时大枣多糖硒铁复合物中铁含量为12. 04 mg/g 、硒含量为3. 414 mg/g，而合成多糖硒铁前大枣多糖硒中硒的含量测得为4. 407 mg/g，从数据看合成前后硒的含量降低了22. 5%。

2.4 结构表征

图6 溶剂的量对铁含量的影响

表2 L9(34)正交试验结果与分析

2.4.1 大枣多糖硒铁紫外光谱分析

三种样品的紫外光谱在260和280 nm附近均无明显特征吸收峰(见图7)，表明多糖、多糖硒、多糖硒铁中核酸和蛋白质含量很低的缘故。实验测得三种样品的特征吸收峰及吸收强度存在明显的差异，说明多糖与硒、多糖硒与铁结合后，结构发生了变化。

2.4.2 大枣多糖硒铁红外光谱分析

图7 紫外光谱图

图8 红外光谱图

对比大枣多糖、大枣多糖硒、多糖硒铁复合物的红外光谱图(如图8所示)可以看出，大枣多糖硒及多糖硒铁复合物与大枣多糖的图谱基本相似，说明多糖经硒化、与铁配位后多糖的基本结构未变。多糖硒化及铁配位后，大枣多糖及多糖硒在3 419 cm-1处的O-H伸缩振动变化不大，而多糖硒铁在此处的吸收峰蓝移至3 417 cm-1处且峰形变尖，说明多糖的羟基可能与Fe3+发生了络合反应[15]；在1 618 cm-1处多糖羧基的C=O伸缩振动与多糖硒和多糖硒铁比，则红移至1 622 cm-1附近，振动强度变大、峰形变窄，可能是羰基参与了硒化反应，并且铁与羰基配位从而引起C=O振动偶极矩变大[2]；多糖硒和多糖硒铁在673 cm-1和892. 00 cm-1附近有两处弱吸收峰，分别归属为Se-H、 C-Se=O[2，16]的伸缩振动吸收峰，而多糖在此未见吸收峰。多糖硒铁在1 024 cm-1和761 cm-1处多了两个特征吸收峰，与文献报道[17，18]的γ-FeOOH在1 024 cm-1及750 cm-1附近的761 cm-1处的Fe-OH的两个特征吸收峰一致，表明多糖硒铁复合物中铁核可能是聚合的γ-FeOOH结构，但具体形成机制尚需进一步研究证实。

3 结果

本文以阿拉尔大枣为原料，采用水热浸提法提取出多糖，然后将多糖硒化修饰后合成出大枣多糖硒，然后再经Fe3+修饰合成出具有良好生物活性的大枣多糖硒铁复合物。研究了反应温度、催化剂用量、加入三氯化铁的量及溶剂的量对大枣多糖硒加铁效果的影响。并采用正交试验优化出大枣多糖硒铁复合物的最佳合成工艺条件：提取温度70℃、提取时间5 h、三氯化铁加入量0. 20 g、溶剂的量70 mL。利用紫外光谱测出大枣多糖硒铁复合物合成前多糖硒中硒的含量为4. 407 mg/g，而合成后硒含量为3. 414 mg/g，加铁后硒含量降低，这可能是因为在合成多糖硒铁的过程中一部分Se-H键或C-Se=O键被破坏；利用可见分光光度法测得大枣多糖硒铁复合物中铁含量为12. 04 mg/g。紫外光谱数据显示多糖与硒(Ⅳ)和铁(Ⅲ)先后发生了反应，红外光谱显示多糖硒铁中含有C-Se=O键和Se-H键，铁以γ-FeOOH结构聚合成铁核。由于大枣多糖硒铁复合物是将大枣多糖与无机硒、无机铁制备而成的有机硒铁复合物， 具有多糖、硒和铁的三重功效， 有望开发成具有良好经济效益的补药品和保健品。

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Study on Synthesis Technology of Jujube Polysaccharide Selenium Ferric Complex

Ding Huiping Gao Yulin Hong Yuanxin Wu Ying Zhang Na*

(College of Life Sciences, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

According to the synthesis principle of organic selenium compounds and organic iron compounds, the synthesis process of the of jujube polysaccharide selenium compound with iron were studied in this paper. Influence of reaction temperature, catalyst dosage, the amount of ferric chloride and solvent on the jujube polysaccharide selenium adding iron were obtained by single factor test and orthogonal design. The results showed that the optimal synthesis conditions of the method for the reaction temperature was 70℃, the reaction time was 5h, the amount of ferric chloride was 0.2 g and the amount of solvent was 70mL. The total contents of Se and Fe in polysaccharide selenium ferric complex were 3.414 mg/g and 12.04 mg/g at the optimum conditions. The UV spectral datas showed that polysaccharide reacted with Se(Ⅳ) and Fe(Ⅲ) successively. The jujube polysaccharide selenium ferric complex contained c-Se=0 and Se-H through the infrared spectrum. Moreover, it was found that Fe(Ⅲ) were aggregated into iron core by the form of γ-FeOOH.

jujube polysaccharide selenium ferric; complex; orthogonal design; structural characterization

2014-07-08

塔里木大学校长基金资助项目(TDZKSS201201)

丁慧萍 (1979-)，女，讲师，硕士，主要研究方向为天然产物化学。E-mail：huiping_ding@163.com

E-mail: hnzhangn@163.com

1009-0568(2015)02-0100-06

O

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2015.02.019