南疆骏枣着色期果面异常褐变分离菌鉴定

刘 凡　朱天生,2　訾莉莉　刘振亚　李龙　刘 涛　熊仁次,2*

(1 塔里木大学植物科学学院， 新疆 阿拉尔843300)(2 南疆农业有害生物综合治理重点实验室， 新疆 阿拉尔843300)



南疆骏枣着色期果面异常褐变分离菌鉴定

刘 凡1朱天生1,2訾莉莉1刘振亚1李龙1刘 涛1熊仁次1,2*

(1 塔里木大学植物科学学院， 新疆 阿拉尔843300)(2 南疆农业有害生物综合治理重点实验室， 新疆 阿拉尔843300)

摘要2013年新疆南疆地区在骏枣着色期果实表面大量发生异常褐变，后期黑斑病发病率高，为探索褐变原因，对病果采样分离获得菌株LF。菌株LF经柯赫氏法则验证可引起类似症状，依据菌株LF形态学特征进行形态学鉴定；分离菌株提取DNA后分别PCR扩增ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase四个基因片段，分别对扩增的4个基因片段测序后登录Genebank进行Blast序列比对和分析，并构建了系统发育树。经形态学鉴定结合分子生物学鉴定，确定菌株LF为链格孢属链格孢Alternaria alternata(Fr.：Fr.)Keissler。

关键词骏枣； 病害； 鉴定

红枣(Zizyphusju jubadaetes)为鼠李科( Rhamnaceae)枣属植物,枣树(Zizyphus jujuba Mill)的果实，在我国已有3000多年的栽培历史。红枣色泽鲜红、皮薄、肉厚、核小、味道甘美清香，其干制品富含多种维生素、氨基酸、多糖、粗纤维、磷、钙、钾等诸多营养保健成分，具有很高的营养价值，被视为良好的滋补品[1]。新疆南疆地区具有光热资源充足，无霜期长，昼夜温差大，降雨少，气候干燥等独特的气候条件，为优质红枣的生长提供了优良的自然条件。

2013年在阿拉尔垦区，9月底10月初大量发生红枣着色期表面异常褐变现象，典型症状表现为从红枣脐部开始整齐的以圈状向果柄部发展，色变与未色变部位交界明显，变色部位较正常部位软，后期易发生红枣黑斑病。本研究对可能引起新疆南疆红枣果面异常褐变的链格孢属菌株进行形态特征和培养性状等形态学研究，并结合18SrDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin 、ATPase基因进行测序和序列分析，对其分离菌株进行鉴定。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1病样采集

2013年从新疆阿拉尔农场和12团采集有典型病状特点的病果。

1.1.2供试植株

新疆塔里木大学园艺站红枣资源圃，4年生骏枣。

1.1.3供试培养基

1.1.3.1PDA培养基

配方：马铃薯：200 g，琼脂：20 g，葡萄糖：20 g，蒸馏水：1 000 ml。

1.1.3.2PCA培养基

配方：马铃薯200 g，胡萝卜200 g，琼脂20 g，蒸馏水：1 000 ml。

1.2试验方法

1.2.1组织块分离及纯化

选择新鲜的病果，先用清水将病果表面冲洗干净，在无菌操作台上，用高温灭菌的解剖刀切取发病枣果病健交界处小块病果组织，用75%的酒精浸泡1～2 min，再用0. 1%的升汞消毒0. 5～1 min，再用无菌水冲洗3～4次，最后将小块组织移放到PDA培养基平板上25℃培养。在培养菌落边缘挑取形态比较单一的小块菌丝块转移到新的培养基平板上培养纯化，纯化菌株编号LF保存于PDA斜面上置4 ℃冰箱内贮存备用[2]。

1.2.2分离菌株致病性测定及再分离

1.2.2.1配置孢子悬浮液

将菌株LF活化后在PDA培养基上25℃培养5～7 d 后，向皿内加无菌水制成孢子悬浮液。悬浮液中孢子量为10×40 倍显微镜下每视野20～40个分生孢子。未产孢的菌株纯化培养4～5 d 时用打孔器打成直径为3 mm 的圆形菌饼以备接种[3]。

1.2.2.2室内接种

将着色期完好无伤的枣果用70%的酒精表面消毒，无菌水冲洗3次。用灭菌的昆虫针刺伤后(深浅一致)，喷施孢子悬浮液，并在刺伤点贴被孢子悬浮液润湿的灭菌滤纸，并用灭菌保鲜膜保湿后置于25℃下保湿培养，观察、记录接种结果,同时将喷施无菌水枣果作为对照，置于相同条件下保湿培养。

1.2.2.3田间接种

选取园艺站内健康枣园进行分离物田间回接。接种方法参照室内接种，然后覆盖灭菌湿脱脂棉，套硫酸纸袋保湿。每处理选树上随机10个健康果。无菌水作对照。

1.2.2.4对回接后病果再分离

回接后对接种后发病的枣果进行病组织再分离，方法同自然病组织分离方法，判断再分离的菌株跟接种菌株LF是否一致，判断其是否为病原。

1.3分离菌株的形态鉴定

1.3.1病原菌的形态观察

用直径5mm灭菌打孔器打取菌株LF在PDA平板上25 ℃培养5 d后是菌落边缘部位，将其移到PCA平板上置于25 ℃条件下培养。5 d后观察菌落形态。

1.3.2产孢表型观察

在比载玻片略小的滤纸中心剪约1×3 cm的长方形小孔，将其贴于载玻片上并放在铺两层滤纸的培养皿内一起灭菌，灭菌完成后，从培养在PCA上的菌落边缘取小块涂抹在小孔周围，然置25 ℃，近紫外灯+日光灯，12 h光照/12 h黑暗循环保湿培养5～7 d，在10×40倍莱卡荧光数码显微镜(DM2000)下拍摄代表该菌株总体特征的产孢表型[4]。

1.3.3分生孢子鉴定与观察

用直径5 mm灭菌打孔器打取菌落边缘部位，将其移到PCA平板置于25 ℃恒温培养箱中培养。培养5～7 d后，在10×40倍莱卡荧光数码显微镜(DM2000)下观察孢子形态并测量50个分生孢子的长、宽、喙长及纵、横隔。

根据病原菌的菌丝、菌落、分生孢子梗、产孢细胞、分生孢子及产孢表型的形态特征，查阅原始资料，鉴定到种。

1.4分离菌株的分子鉴定

采用CTAB的方法提取基因组DNA[5]。采用真菌的rDNA -ITS、EF-1α、β-tubulin基因、ATPase基因引物扩增来鉴定病原菌。扩增引物对及其序列见表1.

表1 PCR所需引物及其序列

rDNA -ITS 序列扩增扩增体系：10×PCR Buffer 2. 5 μL、25 mM MgCl21. 5 μL、10 mM dNTP 0. 2 μL、10 M ITS1 1. 0 μL、10 M ITS4 1. 0 μL、5 U/L TaqDNA聚合酶0. 125 μL，DNA模版1 μL，加ddH2O至25 μL，PCR扩增程序为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min[6]；EF-1α基因和β-tubulin基因的扩增体系：10×PCR Buffer 2. 5 μL、25 mM MgCl22 μL、10 mM dNTP 0. 25 μL、10 M上游引1. 0 μL、10 M 下游引物1. 0 μL、5 U/L TaqDNA聚合酶0. 25 μL，DNA模版1 μL，加ddH2O至25 μL[7]。

EF-1α基因扩增条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min ，72 ℃延伸90 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。β-tubulin扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸7 min；ATPase基因的扩增体系：10×PCR Buffer 2. 5 μL、25 mM MgCl21. 5 μL、10 mM dNTP 0. 2 μL、10 M ATPDF11. 0 μL、10 M ATPDR1 1. 0 μL、5 U/L TaqDNA聚合酶0. 3 μL，DNA模版1 μL，加ddH2O至25 μL，扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸5 min。

将PCR产物送到华大基因科技有限公司进行测序，获得序列后，登陆NCBI网站，进行BLAST同源性比对分析，使用MEGA6.06软件建立进化树，用Bootstrap对系统树进行检验，1 000次重复。

2结果与分析

2.1菌株的分离培养及致病性测定

从发病严重的阿拉尔周边枣园采集病枣，于PDA培养基平板上分离，25 ℃下培养。从病枣上分离、纯化共得到病菌，接种试验后，在健康枣果上观察到刺伤处理的开始发病，无伤接种和对照均没有发病，其发病症状与自然发病的一致。因此，该病菌可以引起红枣果实异常褐变发病，将发病枣果进行再分离试验，获得了与所接种的菌种一样的菌株。根据柯赫氏法则证明接种菌为红枣果实异常褐变的致病菌。

图1　红枣表面异常褐变症状

2.2分离菌株的形态鉴定

2.2.1PDA培养基上的菌落培养性状

用直径5 mm灭菌打孔器打取菌落边缘部位，将其移到PDA平板上置于25 ℃条件下培养。5～7 d后菌落圆形，边缘整齐，中央具有明显的浅灰与墨绿色的同心轮纹，气生菌丝发达，呈薄层絮状，背面呈灰色至暗青褐色。

图2　PDA培养基病原菌菌落形态

2.2.2病原菌产孢表型观察

从培养在PCA上的菌落边缘取小块涂抹在滤纸玻片小孔周围，置于25 ℃，近紫外灯+日光灯，12h光照/12h黑暗循环保湿培养5～7 d。分生孢子梗单生，直立或弯曲，分隔，分枝或不分枝，从基面或主菌丝上生出，淡褐色至褐色，37. 15～158. 48×2. 77～6. 61 μm，平均84. 88×4. 29 μm，产孢方式为合轴式延伸。分生孢子单生或短链生，倒棍棒状或卵形，淡褐色至褐色，表面光滑，具2～5个横隔膜和0～2个纵斜隔膜，分隔处略缢缩，大小为20. 14～43. 87×7. 35～15. 36 μm，平均28. 67×11. 42 μm。分生孢子的短喙柱状，淡褐色，4. 67～20. 27×2. 5～5. 43 μm，平均5. 89×3. 82 μm。根据病原菌的培养特性和形态特征，初步鉴定该病菌为链格孢属链格孢Alternaria alternata(Fr.：Fr.)Keissler。(如图3)

图3　病原菌的产孢表型，标尺=50μm

2.3分子鉴定结果

2.3.1基因组DNA的提取及ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase序列的PCR扩增

利用ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase基因引物对对基因组DNA进行PCR扩增,产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，分别可以获得大小约为530 bp、250 bp、800 bp、1200 bp左右的清晰条带。(如图4)

图4　电泳图

2.3.2基于ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase序列的系统发育分析

图5基于ITS序列构建的系统发育树

用匍柄霉属作为外群，对菌株LF的ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase序列以及下载的序列，用MEGA6. 06软件中的Neighbour-joining方法生成系统发育树进行分析。

在基于ITS序列构建的系统发育树中，菌株LF与下载链格孢属菌株Alternaria alternata、Alternaria tenuissima、Alternaria gaisen、Alternaria brassicae、Alternaria ochroleuca、Alternaria compacta等聚在一起, 说明可以将菌株LF鉴定到链格孢属，但无法鉴定到种。

图6　基于EF-1α序列构建的系统发育树

图7基于β-tubulin序列构建的系统发育树

在基于EF-1α序列构建的系统发育树中，菌株LF与Alternaria alternata聚为一类,说明菌株LF为Alternaria alternata。

在基于β-tubulin序列构建的系统发育树中，菌株LF与Alternaria alternata聚为一类,说明菌株LF为Alternaria alternata。

在ATPase系统发育树中，菌株LF与Alternaria tenuissima( AccessJQ811984)聚在一起,但经过碱基组成分析，Alternaria tenuissima( AccessJQ811984)应为Alternaria alternata，因此在ATPase系统发育树中也是将菌株LF鉴定为Alternaria alternata。

通过ITS、EF-1α、β-tubulin和ATPase四基因结合形态学鉴定，可以将菌株LF鉴定为Alternaria alternata。

3结论与讨论

通过大量分离试验，获得了菌落形态特征较为一致的菌株，经柯赫氏法则证明该分离菌LF即为该病害的致病菌。通过病菌培养形态特征观察及鉴定、并结合18SrDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin 、ATPase 4基因进行测序和序列分析及特异性片段扩增，将南疆骏枣果实着色期表面异常褐变的病原菌确定为Alternaria alternata。

参照Simmons[8]和张天宇对Alternaria属真菌种间分类的培养条件，菌株在PCA+滤纸光暗交替培养条件下的分生孢子形态与A. alternata在自然基质上的分生孢子形态较为一致。A.alternata在PCA+滤纸上培养5～7d天，形成5～10个左右孢子的主链，支链一般1～5个孢子，分生孢子20. 5～39. 0 μm×8. 0～14 μm，喙及假喙0～21. 5 μm×2. 5～4. 0 μm。在PCA上菌落灰色至暗青褐色，基内菌丝和气生菌丝均发达。而分离菌株在PCA平板上菌落灰色至暗青褐色，菌丝发达，就其产孢表型和分生孢子形态、大小而言与A. Alternata的描述基本一致。

为了使结果更具可靠性，分子生物学方法在链格抱菌的系统研究中得到越来越多的应用,为其分类鉴定提供了DNA水平的证据[5]。应用rDNA -ITS区序列进化速度比较快,而且在属间和同一种属不同种间存在着广泛的多态性,所以对ITS区PCR来进行病原菌的分类鉴定已成为国际上广泛使用的技术[9]。但是由于小孢子同源性极高，在基于ITS序列构建的系统发育树中，可以将菌株LF鉴定到链格孢属，但无法鉴定到种; 在基于EF-1α和β-tubulin序列构建的系统发育树中，菌株LF与Alternaria alternata聚为一类,说明菌株LF为Alternaria alternata；在ATPase系统发育树中，菌株LF与Alternaria tenuissima(AccessJQ811984)聚在一起,但经过碱基组成分析，Alternaria tenuissima( AccessJQ811984)应为Alternaria alternata，因此最终在ATPase系统发育树中将菌株LF鉴定为Alternaria alternata。

参考文献

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[2]王义勋. 苍术黑斑病病原学研究.华中农业大学[D].植物科技学院，2006.

[3]王叶. 枣果实病原真菌的鉴定及链格孢属病原真菌多样性研究[D].河南农业大学.2013.

[4]张天宇. 中国真菌志[M]．第十六卷:链格孢属．北京:科学出版社，2003:33-42.

[5]刘娟. 柑橘园链格孢菌的鉴定与防治[D].重庆：西南大学.2011.

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[7]臧睿.中国苹果树腐烂病菌的种群组成、分子检测及其ISSR遗传分析[D].杨凌：西北农林科技大学.2012.

[8] Simmons.E.GAlternaria:An Identification Manual[M].Utrecht:CBS Fungal Biodiversity Centre,2007:147-152

[9]王洪凯,张天宇,张猛.应用5.85rDNA及ITS区序列分析链格抱种级分类[J].菌物系统,2001,20(2):168-173.

Identification of Alternaria Isolated from Jun Jujube with Brown Stain

Fruit Surface in Coloring Period South of Xinjiang in China

Liu Fan1Zhu Tiansheng1,2Zi Lili1Liu Zhengya1Li Long1Liu Tao1Xiong Renci1,2*

(1 College of Plant Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

(2 Integrated pest management of agricultural Key Laboratory in South of Xinjiang, Alar, Xinjiang 843300)

AbstractAs the jujube fruit surface coloring period large abnormal browning, late black spot disease incidence rate was high in 2013 in the south of Xinjiang, in order to explore the cause of disease fruit browning, LF strain was isolated.It could cause similar symptoms by Koch verification , according to strain LF morphological identification, combining with the analyis of amplified ITS sequences, EF-1 alpha, beta -tubulin and ATPase four fragment after isolates extraction DNA, and constructed phylogenetic tree, the strain LF was Alternaria alternata (Fr:Fr.) Keissler by morphological identification and molecular biology identification.

Key wordsJun jujube; plantdisease; identification

中图分类号：S-43

文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2015.04.001

文章编号：1009-0568(2015)04-0001-09

通讯作者*为E-mail： xrcqwb@163.com

作者简介：刘凡(1993-)，女，2015级本科生，研究方向为果树病理学。E-mail：514540659@qq.com

基金项目：国家大学生创新项目(201410757032)；新疆生产建设兵团产学研重大合作科技专项(2013AA001-1)；北京市援助和田科技攻关项目(201106)。

收稿日期:2015-05-11