连翘中具有药物活性成分内生菌的筛选及其拮抗特性的研究

刘玉珍，高 飞，马雪燕，苏 瑞，魏婷婷，段阳阳，邓振山

（延安大学生命科学学院，陕西延安716000）

连翘中具有药物活性成分内生菌的筛选及其拮抗特性的研究

刘玉珍，高 飞，马雪燕，苏 瑞，魏婷婷，段阳阳，邓振山*

（延安大学生命科学学院，陕西延安716000）

采用组织分离法从连翘枝条中筛选出13株内生菌，其中有7株内生真菌，6株内生细菌。分别以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为指示菌株，采用平板对峙法对分离出的13株内生菌的抗菌活性进行筛选。结果表明：13株菌种中有10个菌株对1种供试菌具有抑菌活性。其中L－07－01、L－07－09、L－07－12、L－07－13的拮抗效果明显，L－07－09对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌效果，测量其抑菌圈直径为10mm。L－07－12对大肠杆菌具有较强抑菌效果，测量其抑菌圈直径为10mm。对拮抗效果较强的菌株进行液体发酵培养后采用双层打孔法，测定其抑菌效果后证明L－07－13对金黄色葡萄球菌有极强的抑制效果。对拮抗后的指示菌进一步镜检后，发现菌体有明显的溶菌、空洞、畸形等现象。连翘内生菌可以产生丰富的具有药物活性的次生代谢产物，可作为新型药物的筛选源。

连翘；内生菌；药物活性；拮抗性

植物内生菌（Endophyte）是指那些在其生活史中某一段时期生活在活的植物组织中，并不引起植物组织产生明显病害症状的菌［1，2］。研究发现内生菌次生代谢产物具有抗肿瘤［3］、抗病［4］、抗虫等活性。因此从内生菌中筛选次生代谢活性物质的研究非常活跃，并已取得了很多进展。内生菌是一个生态学概念，而非分类学单位。是植物微生态系统的天然组成部分。植物内生菌不仅将植物作为其栖息场所，而且对寄主有促生、防病、内生联合固氮等广泛的生物学作用，是植物病虫害防治，内生联合固氮菌筛选，诱导抗病性及转基因载体的天然菌源，具有较高的理论研究价值和实际应用价值，已成为微生物和植物学学科的研究热点［5，6］。内生菌包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌。

近年来，从东北红豆杉、三尖杉、南方红豆杉、云南桃儿七、川八角莲、南方山荷叶中都已分离出了具有抗肿瘤活性物质能力的内生真菌菌株［7，8］。2003年，陈毅坚等从云南红豆杉树皮和枝条中分离得到52株内生真菌，其中有19株经过TLC／HPLC分析产紫杉醇，产量在万分之一以上的有8株。郭波等从云南长春花植物中分离出21株真菌，其中有4株产长春新碱类似物。李海燕等从桃儿七植株中分离到28株真菌，其中有两株产鬼臼毒素类似物。王梅霞等用常规组织分离法从银杏中分离获得了33株内生真菌，其中有一株能明显产生银杏黄酮类化合物［9］。

连翘（Fructus forsythiae）为木犀科植物，主产于我国山西、河南、陕西、山东等地，有清热解毒，散结消肿之功效，主治温热、丹毒、斑疹、痈肠肿毒、小便淋闭等症。目前，国外学者对连翘化学成分及其药理作用研究较多，发现其有多种生理活性，从连翘中提取出了一些成分，如：苯乙醇苷类、五环三萜类、木脂体及其苷类、挥发油等物质，但有关其内生菌的研究却鲜见报道。鉴于此，本文通过对连翘内生菌进行分离纯化，并从中筛选出对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显拮抗作用的菌株，旨在为生物防治、疾病治疗等方面提供新的研究途径和良好的菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料的采集

连翘材料均采自延大校园内，2014年3月至5月采集连翘侧枝（不带叶），采样后立即带回实验室备用。

1.1.2 培养基成分及组成

1）分离纯化用的固体培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂20g；水1000mL；pH自然。

2）摇瓶发酵的液体培养基

马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯200g；葡萄糖20g；水1000mL；pH自然。

1.1.3 供试病原菌

大肠杆菌（Escherichia coli.）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

1.2 连翘内生菌的分离与纯化

1.2.1 组织分离法

取采集新鲜的连翘枝条，用自来水冲洗干净后带入无菌操作室用浓度为70％的酒精浸泡3 min→无菌水冲3～4次→浓度为0.1％安替福民漂洗3 min→无菌水冲洗4次。按无菌操作法将上述处理过的材料剪切成0.5 cm的小段，种植于PDA培养基平板上。置于28℃培养箱中培养5～7 d，当观察到实验材料边缘有菌丝长出后，挑取其尖端部分，转接到新的PDA平板上进行扩大培养，待长出后进行纯化。将纯化后的菌转入斜面试管保存［10，11］。

1.2.2 表面消毒效果及检测

在无菌条件下将上述处理过的植物组织用无菌水在培养基上冲洗一次，置于28℃培养箱中培养5～7 d，每个样重复做3次，检查是否有微生物长出。

1.2.3 内生菌的液体发酵培养

1）菌种活化培养

将斜面中保藏的菌株，用接种环挑取其尖端部分，转接到PDA固体培养基上进行扩大培养。

2）摇瓶液体发酵培养

待平板内菌体长出后在无菌条件下取直径6 mm菌块接种于已灭菌的PDA液体培养基培养，每250mL三角瓶中加入60mL培养基，分别置于28℃的摇床120r／min振荡培养8～10d。

3）发酵液处理

用移液枪在无菌条件下分别取1mL发酵液于离心管中，置于高速离心机中以3000r／min离心3 min，取上清液备用［12］。

1.2.4 连翘内生菌的拮抗作用测定

平板对峙法：无菌条件下，在PDA培养基中同一直线上相距5 cm处两点接种，一点接种直径5 mm内生菌菌块，另一点接种直径5 mm供试菌菌块（直径9 cm培养皿，20mL PDA／皿）。

设单接内生菌和单接各供试菌的平板作为对照。设3次重复，置于28℃恒温箱培养，观察。观察供试菌株与内生菌之间是否有拮抗作用，并测量抑菌圈直径［13，14］。

1.2.5 发酵液拮抗作用的测定

双层打孔法：先在平皿底部倒入一薄层PDA培养基（直径为15 cm的大平皿25 mL）为下层；上层为供试菌悬液与PDA培养基的混合液（30mL为宜），或者直接倒一层PDA培养基（30mL），待PDA冷却后再将供试菌悬液涂布在上面；然后在上层培养基中用打孔器打孔，孔中加入发酵液，以PDA培养基为对照。实验设3次重复，置于28℃恒温培养箱中3～4 d后测量抑菌圈的直径。对照实验其他条件相同，孔中加入无菌水［15］。

2 结果与分析

2.1 连翘内生菌的分离纯化结果

从连翘中共分离出13种内生菌。其编号L－07－01、L－07－02、L－07－03、L－07－04、L－07－05、L－07－06、L－07－07为内生真菌，L－07－08、L－07－09、L－07－10、L－07－11、L－07－12、L－07－13为内生细菌。内生菌菌落培养特征描述（见表1）。

由表1可知，这些内生菌的基本形态都不完全相同，其中白色居多，多为不透明的边缘整齐的菌株。在实验过程中还发现很多菌株具有产生色素的现象，产生的色素大多为黑色。

经表面消毒过程处理后培养，没有观察到任何菌落生长。表明经过表面消毒过程，样品表面附生菌影响已经消除，分离的菌株均来自于样品内部，且与组织结合紧密。

表1 不同内生菌经培养后在PDA培养基上的颜色及特征

图1 部分菌株对金黄色葡萄球菌的拮抗作用

2.2 连翘内生菌拮抗作用测定结果

由图1可知：平板中接种了金黄色葡萄球菌单菌落的平板，能明显看到两菌之间对峙的地方有明显抑菌带。L－07－O9和L－07－13抑菌效果极为明显，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌几乎没有生长。并且形成了极为明显的抑菌圈。

由表2、表3可知：内生真菌中L－07－05、L－07－06对金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显，L－07－01、L－07－05对大肠杆菌的抑菌效果明显。内生细菌中L－07－09、L－07－13对金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显。L－07－09、L－07－12对大肠杆菌的抑菌效果明显。

表2 各菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径结果表

表3 各菌株对大肠杆菌的抑菌圈直径结果表

2.3 发酵液抑菌效果

采用双层打孔法对平皿对峙实验中筛选出的至少对一种供试菌株的抑菌圈直径大于6 mm的菌株发酵液的抑菌活性进行了测定。结果发现L－07－13号菌株对金黄色葡萄球菌拮抗效果最明显，整个平板表面长满L－07－13号菌株，金黄色葡萄球菌没有生长。其中L－07－03、L－07－09内生菌在平皿表面虽没有生长，但金黄色葡萄球菌生长颗粒与对照组相比明显减小。说明L－07－03、L－07－09对金黄色葡萄球菌也有抑制效果，但不太明显，对照中的平板上长满大的颗粒状的金黄色葡萄球菌。

对照培养的金黄色葡萄球菌为葡萄状，但经拮抗试验后的指示菌金黄色葡萄球菌菌株明显观察出菌体发生变化，由原来的葡萄状菌体变为离散的单个菌体，且菌体畸形，变为月牙状、棒状，菌体发生自溶、内含物外泄呈空心状等现象（见图2）。

图2 菌株L－07－09拮抗后的金黄色葡萄球菌

3 讨论

植物内生菌作为植物微生态系统中重要的组成部分，对增强宿主植物对环境适应能力具有重要意义，内生菌与宿主植物在长期的协同进化过程中构成了一种稳定的生态关系［10］。本试验采用组织分离法对连翘枝条的内生菌进行分离培养，共分离出13株内生菌，其中有7株内生真菌，6株内生细菌。

表面消毒是内生菌分离的重要环节［16，17］。为确保所分离到的微生物为连翘内生菌，试验过程中对所消毒材料冲洗后的无菌水进行涂板培养，如在5～7 d内没有微生物生长，则认为该材料消毒彻底，证明所分离到的为内生菌。但本试验所采用的消毒方法易于杀死植物体内微生物，因而所分离到的内生菌种类与数量可能比植物体内所含的要少。因此，在进行内生菌分离过程中，掌握适宜的消毒时间对最终分离到的内生菌数量和种类都有重要作用。

抑菌活性试验表明，所分离菌株中有9株菌对2种供试菌都有不同程度的抑制作用，占总分离菌株数的69.2％，这与植物内生菌具有抑菌活性的相关文献报道是一致的［18，19］；试验中有4株菌对金黄色葡萄球菌有明显抑制作用，有4株菌对大肠杆菌具有明显抑菌活性，试验中有2株菌对2种供试菌都有明显抑制作用，表明药用植物连翘内生菌具有广泛的抗菌活性，这可能与连翘具有药用特性有关，这为筛选具有广谱和选择性抗菌药物提供了资源。

连翘内生菌有其特殊之处，又有多方面的应用潜力，是一个尚待开发的微生物资源，尤其是内生菌次生代谢途径与次生代谢产物的研究在其抗菌、抑菌机制与药用价值方面有重要的研究意义。因此，对于连翘内生菌的研究还需要从以下几个方面进行：对连翘叶、根中内生菌的筛选，以获得更多的菌种资源；对内生菌合成途径及其发酵产物的成分进行研究；对连翘内生菌所产生的有效物质进行药理和毒理作用的研究，以明确其是否与连翘有效成分具有相同的药用功效，以便为今后利用内生菌发酵生产天然药用活性成分提供有力的理论依据。

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［责任编辑 李晓霞］

Screening of Drug Active Products Endophytic from Fructus Forsythiae and Study on Their Antagonism

LIU Yu-zhen，GAO FEI，MA Xue-yan，SU RUI，WEITing-ting DUAN Yang-yang，DENG Zhen-shan*
（College of Life Science，Yanan University，Yanan 716000，China）

Thirteen strains of endophyte were isolated from Fructus forsythiae branches were screened by using organizationmethod separation，including seven strains of endophytic fungi，six strains of endophytic bacteria.Respectively to Staphylococcus aureus，Escherichia colias the indicator strain，on the isolated thirteen strains of endophytic bacteria antimicrobial activity was screened by plate confrontationmethod.The results showed that：thirteen strains in ten strains of one species of tested bacteriawith antimicrobial activity.One obvious antagonistic effectof L－07－01，L－07－09，L－07－12，L－07－13，L－07－09 has a strong inhibitory effect on Staphylococcus aureus，measuring the inhibition zone diameterwas10mm.L－07－12has a strong inhibitory effecton Escherichia coli，measuring the inhibition zone diameter was 10mm.The antagonistic effect of strong strain liquid fermentation and culture after using double diffusion method，the determination of the antagonistic effect after demonstrated that L－07－13 has a strong inhibitory effecton Staphylococcus aureus.To further check of lens of indicator bacteria antagonistic after cells have obvious lysis，empty and abnormal.Fructus forsythiae endophyte can produce abundant secondarymetaboliteswith activities，it can be used as a source of new drugs screening.

Fructus forsythiae；endophyte；drug active；antagonism

10.3969／J.ISSN.1004－602X.2014.04.084

S482.2

A

1004－602X（2014）04－0084－05

2014-11-01

国家级大学生创新训练计划项目（201310719007）

刘玉珍（1993—），女，福建宁德人，延安大学生命科学学院学生。*通讯作者