白玉菇液体培养状况的测定

姚 尧，任玉合，任桂梅，2，王延峰，2*，贺晓龙，2

（1.延安大学生命科学学院；2.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西延安716000）

白玉菇液体培养状况的测定

姚 尧1，任玉合1，任桂梅1，2，王延峰1，2*，贺晓龙1，2

（1.延安大学生命科学学院；2.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西延安716000）

为了对白玉菇液体培养终点进行测定，本论文主要采用培养过程中的菌丝球数量、pH、还原糖和菌丝干重等指标，对白玉菇液体培养的终点进行测定。结果表明，当培养液的pH为5.38，还原糖含量是3.87时，菌丝球的数量与活性最高，并且菌丝得率最高，此时也是白玉菇液体培养的终点，相比较于固体原种的培养周期缩短了5～10d。

白玉菇；液体菌种；还原糖；pH；菌球数

近年来，随着人们的生活水平的不断提高，食用菌作为新的绿色营养保健食品受到广大消费者的青睐，消费需求在不断得扩大，可见食用菌产业已成为我国农业生产中的一个重要产业［1］。

白玉菇（Hypsizigusmarmoreus）属于伞菌目、口蘑科、白蘑属，是北温带地质优良的珍稀食用菌。白玉菇的蛋白质含量比一般蔬菜的含量高，必需氨基酸比例合适，并且含有大量多糖和各种维生素以及多种微量元素等人体必需物质，白玉菇在液体培养过程中还能产生多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素等多种生理活性物质［2］。

随着白玉菇逐渐进入大众眼球，国内出现了大量的针对白玉菇生物特性、栽培条件等方面的研究，而在液体培养方面的研究则相对较少［3］。目前白玉菇液体培养的技术相对落后，检测手段单一，难以监控白玉菇液体培养的整个环节，因此利用液体培养发展白玉菇则少之又少。而本试验则通过对白玉菇液体培养过程中不同物质的含量变化来检测培养状况，丰富和加强了检测手段，从而对发展白玉菇液体培养代谢产物和液体制种提供准确的试验参考，为白玉菇工厂化提供广阔的研究前景。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 供试药品及菌种

琼脂粉，葡萄糖，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1，维生素B2，氢氧化钠，酒石酸钾钠，3，5－二硝基水杨酸，等。

白玉菇菌种（延安大学生命科学院食用菌实验室提供）。

1.1.2 仪器设备

超净工作台，UV－2550型紫外可见分光光度计，HV－110型立式压力蒸汽灭菌器，101－3型电热鼓风干燥箱，ZJS－1320气浴式振荡器，MP200A型电子天平，HHS－25C型pH计，KDC－160HR型高速冷冻离心机，隔水式电热恒温培养箱等实验室常用仪器设备。

2 主要实验方法

2.1 培养基配方

母种培养基配方：葡萄糖20g，马铃薯200g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，维生素B12片，琼脂20g，蒸馏水1000mL，常规技术制备［4］。

液体培养基配方：土豆200g煮汁1000mL，玉米粉15 g，葡萄糖15 g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5 g，维生素B10.1mg，维生素B20.5 mg。

2.2 液体培养方法与测定

2.2.1 液体培养方法

将液体培养基装入150mL的三角瓶中，每个三角瓶装入50mL，在121℃、0.12MPa压力下灭菌30min，冷却后进行无菌检验，确认无菌后在超净工作台中采用无菌技术给每个三角瓶中接入培养了7 d的斜面活化的3块1cm2菌种，静置1d后在230r／ min摇床培养1d作为试验前培养。而后在180r／min的摇床开始培养9 d，培养温度为25℃，每天取3瓶检测各项指标［5］，结果取其平均值，绘制图表。

2.2.2 葡萄糖标准曲线的制作

取9支规格大小相同具塞刻度试管，编号，按表1操作，然后将各管摇匀，同时置于沸水浴中，准确加热5 min（必须严格控制反应过程的温度和加热时间），取出后立即用冷水冷却到室温，加蒸馏水21.5 mL，混匀。用UV－2550型紫外可见分光光度计在波长540nm处以0号管为对照，分别测定其余各管吸光度。绘制标准曲线，见图1［6］。

表1 还原糖标准曲线配制表

图1 葡萄糖标准曲线

2.2.3 指标测定

菌球计数：利用培养皿计数和血球计数板计数两种方法综合计数。培养皿计数：吸取1mL培养基稀释10mL，取1mL稀释液置培养皿中，皿下衬黑白相间方格纸计数［7］。血球计数板计数：吸取1mL培养基稀释10mL摇匀，取200μL置于血球计数板中，在10倍光镜下观察计数。

pH值测定：用pH计测量培养液中部的pH值。

还原糖测定：用3，5－二硝基水杨酸法检测液体中还原糖含量。

菌丝干重：抽滤后的菌丝球用蒸馏水反复多次冲洗，置于60℃烘箱中烘至恒重后称其重［8］。

3 结果与讨论

3.1 液体培养菌丝球数量

对于菌丝球的生长变化，采用血球计数板法和培养皿法相结合的的测定方法来计算培养液中菌丝球的数量，以1d为测定周期，密切观察菌丝的生长情况和菌丝球的形态数量变化，结果如图2和图3所示。

图2 白玉菇菌丝数量变化图

结合图2和图3综合比较可以得出，在开始培养的1～2d中，由于菌丝处在一个短暂的修复期和适应期里，所以菌丝球的生长活力比较低，菌丝球数量基本无变化；培养3 d以后，菌丝的活力开始恢复，菌丝球的数量也出现了指数增长，在第6～7 d的时菌丝球的活力最旺盛，菌丝球的数量也增长到最高值；之后由于菌丝数量过多，培养液营养持续减少，菌丝数量由盛转衰，数量开始急剧减少，活力开始降低，菌丝质量也变差。而这种菌丝球数量曲线与白玉菇的生长曲线基本相同。

图3 白玉菇菌丝球数量变化图

3.2 培养液pH值

白玉菇pH值变化，结果见图4。

图4 白玉菇pH值变化图

从图4可以看出，在培养期间液体的pH变化很小，基本上保持不变，从整个培养周期来看，略有上升。这是因为白玉菇液体培养初期菌丝分级机制产生部分有机酸，在后期菌丝球老化姿容产生碱性物质，是培养液的pH略微升高。而如果培养液的pH持续走低，培养液浑浊或者气味变化较大，基本可以认定为杂菌污染。

3.3 培养液还原糖

白玉菇还原糖变化趋势，结果见图5。

通过图5可以看出，培养液中的还原糖总体含量是下降的，第1—3天为菌丝快速生长，消耗大量的还原糖，第3—6天还原糖的含量基本保持稳定，菌丝产生的还原糖与消耗的基本相同，处在一个动态平衡中。第7天以后还原糖含量又开始下降，这是由于菌丝开始老化死亡，产生得少，而消耗得多。因此，根据还原糖的变化曲线，我们可以将第6—7天作为培养终点。

3.4 菌丝干重

白玉菇菌丝干重变化，结果见图6。

图6 白玉菇菌丝干重变化图

根据图6所示，菌丝重量总体是增加的，第1～3 d菌丝重量开始增加，但幅度很小，第4～6 d为菌丝生长的旺盛阶段，菌丝重量不断增加，第7 d菌丝重量达到最大，之后菌丝重量开始减少，这与菌丝球数量关系基本相符合。

4 结论

本试验通过对白玉菇液体培养过程中的菌丝球数量、pH、还原糖和菌丝干重等相关数据的测定，基本绘制出了白玉菇液体培养周期的各生理生化的变化曲线图，通过这些变化趋势在不同的发酵终点收集不同的发酵产物。pH值以及还原糖含量可以作为终点标准之一，但不能成为唯一标准，必须各项数据之间相结合，从而才能更为准确、有效地获得预期的产物。

因为白玉菇是好氧菌，转速过低，溶氧不足，不能满足白玉菇菌丝的生长要求，转速过高会损害菌丝体的生长，所以采用180r／min；温度对白玉菇的生长影响也极其显著，白玉菇的最适生长温度为25℃，比一般的食用菌的生长温度低；白玉菇的生长培养基pH范围比较较广，一般采用自然pH；培养时间对白玉菇菌丝生长也有着显著的影响，因此找出最佳的生长时间对于培养白玉菇的培养也是很重要的。而此次试验由于实验时间以及相关器材，本论文未对白玉菇的生理生化的多数数据进行测定，在下一阶段的实验中会进一步进行完善。

截至目前，查阅了相关文献资料目前尚未见白玉菇菌丝体深层发酵方面的研究报道，国外也没有白玉菇子实体和菌丝体成分比较全面的研究报道，这将是白玉菇一个新的研究方向。白玉菇有着长远的研究前景，而我国对白玉菇的研究正处在起步阶段，相信随着研究的不断深入，我们必将挖掘出白玉菇更多的价值。

［1］柴新义，汪美英，许雪峰，等.我国食用菌产业的发展及开发策略［J］.资源开发与市场，2006（4）：27－28.

［2］邓超，邬敏辰.食用菌深层发酵及其多糖活性研究进展［J］.安徽农业科学，2007（15）：128－130.

［3］Mihall JD.Bruhn N.Bonello P.Spatial and temporal patterns ofmorel fruiting［J］.Mycological Research，2007，111（3）：339－346.

［4］张树庭，Miles PG.食用蕈菌及其栽培［M］.河北：河北大学出版社，1992，11－12.

［5］魏群.基础生物化学实验［M］.北京：高等教育出版社，2009，7

［6］张甫安，蒋筱仙，王镛涛.食用菌制种指南［M］.上海：上海科学技术出版社，1992，11.

［7］张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术［M］.北京：高等教育出版社，1997，7.

［8］王宜磊，赵良田.彩绒革盖菌多酚氧化酶活性研究［J］.植物学通报，1999，16（4）：454－456.

［责任编辑 李晓霞］

Determ ination of Hypsizigus Marmoreus Using Liquid Cultivation Situation

YAO YAO1，REN Yu-he1，REN Gui-mei1，2WANG Yan-feng1，2*，HE Xiao-long1，2
（1.College of Life Science，Yanan University；2.Shaanxi Engineering and Technological Research Center for Conversation and Utilization of Regional Biological Resources，Yanan 716000，China）

In order to determine the cultivation terminal point of Hypsizigusmarmoreus this thesismainly uses index of the quantity of bulb forms，pH，reduction sugar and dry weight of the turf course of in the cultivation.The result shows that bulb formswill have the supreme amount and active hyphae and have a highest rate of turf gainingwhen the pH of cultivation liquid is 5.38，the content of reduction sugar is 3.870，at this time，this is also the terminal point of the Hypsizigusmarmoreus；compared with the solid＇s original seeds，its cultivation period shortens 5～10days.

hypsizigusmarmoreus；liquid spawn；reducing sugar；pH；bacteria the count

Q935；S567.39

A

1004－602X（2014）04－0092－04

10.3969／J.ISSN.1004－602X.2014.04.092

2014-10-18

陕西省高水平大学建设项目（2012SXTS06）；陕西省科学技术农业攻关项目（2011K02－11）；陕西省2014年省级大学生创新创业训练计划项目（1097）；延安市科技计划项目（2011KG－15）

姚 尧（1989—），男，陕西丹凤人，延安大学在读硕士研究生。*通讯作者