HPV18融合转录本E1/CCAT1在宫颈癌筛查中的应用

鲁伟 姚轶敏 李强

HPV感染与宫颈癌及癌前病变的发生发展密切相关，而高危型HPV病毒整合入宿主细胞是细胞转化及癌变的关键［1-3］。迄今为止，共有超过250个HPV-host整合位点被报道［4］。随着二代测序及生物信息学的发展，研究发现HPV-host整合后可产生大量的HPV-host融合基因，并进一步转录形成新的融合转录本［5，6-8］。

HPV病毒感染与宿主基因组发生整合产生的转录本（序列）在癌症的诊断治疗中具有一定意义［5］。HPV18作为HPV高危型病毒，与宫颈癌的发生发展密切相关，Hela细胞系是一类携带了HPV18病毒的细胞株，通过检测HPV18宿主基因的融合转录本，有可能为HPV18相关宫颈癌的诊疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年2月至2020年3月于本院行宫颈活检或手术治疗的HPV感染患者62例。其中，宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅰ21例，CINⅡ/Ⅲ共28例，宫颈癌（cervical carcinoma，CC）13例；年龄35～57岁，中位年龄为46岁。收集62例HPV感染患者经阴道镜活检、锥切术或手术切除的部分宫颈组织，-70 ℃液氮保存，将因宫颈良性病变行全子宫切除的非HPV18感染患者作为对照组。另收集同期门诊或体检进行宫颈癌筛查的女性105例，年龄22～65岁，平均41岁。所有患者均经上海透景生命科技股份有限公司HPV核酸分型确定为HPV18感染。

1.2 细胞株培养 人正常宫颈细胞及宫颈癌细胞系Hela（HPV18阳性）购自美国典藏培养中心，置于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。

1.3 HPV与人融合基因的引物合成 通过检索Pubmed SRA数据库，筛选出HPV18阳性的宫颈上皮细胞的RNA-SEQ数据（SRR2185953）。利用生物信息学方法（Fusion-finder）［9］从HPV18阳性的宫颈上皮细胞的RNA-seq的数据中筛选出可能存在的HPV18病毒-宿主基因融合转录本。采用PCR等方法对其在HeLa细胞株、临床宫颈组织和上皮细胞标本进行验证。共筛选出16个可能存在的HPV-host融合转录本，针对融合转录本的基因融合区域设计引物，部分转录本因序列过短未进行验证，共设计验证10对引物，引物由上海生工合成，见图1和表1。

表1 HPV18与宿主产生的融合转录本及引物信息

图1 E1/CCAT1融合转录本（非编码RNA）产生示意图

1.4 Hela细胞、宫颈上皮细胞、癌组织基因相对表达量检测 收获培养细胞1～5×107，移入1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol，混匀，室温静置5 min；取50～100 mg宫颈组织或1 mL宫颈刷取物置1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol 充分匀浆，室温静置5 min。采用核酸提取试剂盒（磁珠法，上海之江生物公司）提取所有标本总RNA，具体操作步骤按试剂说明书进行。再利用已经设计好的针对HPV与人融合基因的引物，用TaKaRa公司PCR试剂盒在cobasZ480扩增仪上逆转录并扩增，E1/CCAT1基因上游引物：5′-GGTTCATGTCTCGGCACCTT-3′，下游引物：5′-GGTGTGCATCCCAGCAGTAA-3′。C-MYC基因上游引物：5′- ATTTGAGGCAGTTTACATTATGG -3′，下游引物：5′-AAACACAAACTTGAACAGCTAC-3′。以GAPDH作为内参对照。引物反应体系为20 μL（包括上下游特异性PCR引物各0.8 μL、TaKaRa Ex Taq HS 1.2 μL、PrimeScript RTaseMix 0.4 μL、灭菌超纯水4.8 μL、One Step TB Green RT-PCR Buffer 10 μL、total RNA 2 μL）。逆转录反应条件：42℃5 min，95 ℃10sec，20℃/sec，进入PCR循环，循环参数为95 ℃5sec，60℃ 20sec，20℃/sec循环40次。采用2-△△Ct法计算E1/CCAT1、C-MYC相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件。计数资料以［n（%）］表示，多组间比较采用卡方检验。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用ANOVA单因素方差分析。组织E1/CCAT1相对表达水平与C-MYC的相关性采用Pearson相关分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV18阳性的HeLa 细胞中E1/CCAT1融合转录本表达 HeLa细胞株中可检出4个融合转录本，包括E1/CCAT1（E1_1489084/Chrom8_128，231，211）、E1/CASC19（E1_1489084/Chrom8_128，215，465）、E1/intergenic（E1_1489084/Chrom8_128，241，488）、E1/CCAT1（E1_1489084/Chrom8_128，221，962）。其中，融合转录本E1/CCAT1（E1_1489084/Chrom8_128，231，211）的检出丰度明显高于其他融合转录本。E1/CCAT1融合转录本，宿主基因为CCAT1，整合位点位于8号染色上的128，231，211；HPV病毒基因E1，整合位点位于E1上的929。以下黑色加粗部分为插入的HPV E1基因序列：TTTCAGAAAGAGCGTCAGGGTTGACAG TAGCTGTGATGCTCCAGATGGAGCTGCGGATAACAGC ATATAAGTTTCAGGGCAGTGGTTGAGGGGCTGTGGGA GGGTGGGGAGGGAAGATGGATGACTTTTCTCAACCAT CTGTATTTGATTGGAATATTGTGTGACTTGTGAAATAG AATTAAAGATATGATCTTCTTATGGTCTTCTCACAGTT TTCAAGGGATTTTAGGAGAAAACGCTTAGCCATACAG AGCTTCTGGATCAGCCATTGTTGCTTCTGCTGGGATGA AACTTCAAAGTCGATGTTGTCAGTGAATGCTCCAGAT GGATTGCAGAGAAGACCAAAGTTCATGTCTCGGCACC TTTCGCAT。

2.2 E1/CCAT1在宫颈病变组织和脱落细胞中的表达情况 在62例HPV18感染患者的宫颈组织中共检测出17例E1/CCAT1的表达，CIN1阳性表达率为23.8%（5/21），CINⅡ/Ⅲ为25.0%（7/28），宫颈癌38.5%（5/13），相对于宫颈脱落上皮细胞9.5%（10/105）的阳性表达率，显示出较高的融合比例。三组组织标本的阳性表达率比较，差异无统计学意义（χ2=1.016，P＞0.05），见表2。但是，相对表达水平随着宫颈癌病变程度加重，呈现逐级升高趋势，见图2a。

表2 不同来源的HPV18感染标本E1/CCAT1表达情况

2.3 E1/CCAT1与C-MYC表达的相关性分析 通过检测上述组织标本中C-MYC，其相对表达水平亦随着宫颈病变程度呈现上升趋势，见图2b。通过对宫颈病变组织中E1/CCAT1和C-MYC的表达水平进行Person相关性分析，发现两组之间呈正线性相关（r=0.918，P＜0.001），见图2c。

图2 E1/CCAT1和C-MYC的相对表达量及相关性分析

3 讨论

高危型HPV感染是发生宫颈癌的主要风险因素［10］，WHO推荐高危HPV检测用于宫颈癌初筛，HRHPV阳性者再行阴道镜检查［11-12］。成年女性几乎均会发生HPV感染，虽然95%以上的宫颈癌均可检测到HPV病毒的癌蛋白表达，但仅有极少数高危型HPV感染最终会发展成为宫颈癌。深入探索HPV的致病机制及其与宫颈癌的内在关联，寻找可以精确反映宫颈癌发生及预后的标记物，开发高效、简便的宫颈癌癌前病变诊断新技术，具有重要的社会及经济意义。研究发现，HPV与宿主基因组的整合是宫颈细胞永生化过程中的“one-shot”机制［13］。HPV 感染宿主细胞后通常以游离状态存在，首先潜伏在基底细胞层，其DNA以独立的外源性染色体状态游离于被感染细胞核内，继之HPV核酸整合至宿主细胞内，表达病毒癌基因的同时导致宿主细胞相关基因表达发生变化，并逐渐发展为宫颈癌。

E1是解旋酶，也是HPV编码的唯一酶［14］。HeLa细胞中沉默的HPV18 E1上调了参与宿主免疫反应和细胞周期调控的基因，表明E1在致癌作用中具有一定作用［15］。E1还可以诱导DNA损伤，抑制细胞生长并募集宿主细胞来增加病毒复制［16］。压力作用下，E1以低保真度复制HPV DNA，并产生双链断裂，可能是致癌因素的驱动因素［17］。研究发现，人类8号染色体的结肠癌相关转录因子1（colon cancer associated transcript 1，CCAT1）基因座与HPV18病毒的E1_1489084基因融合产生的融合转录本E1/CCAT1，C-MYC基因是位于染色体8q34上的一个癌基因，位于CCAT1基因座下游，作为转录因子受CCAT1调控。CCAT1是一个2628 nt 的非编码长链RNA（long noncoding RNA，lncRNA），位于染色体8q24.21，与多种生物学过程如染色体沉默、染色质修饰、转录激活剂干扰有关，与肿瘤的发生发展、浸润、转移密切相关，是重要的致癌基因［18-19］。CCAT1位于转录因子C-MYC 附近，可与C-MYC相互作用进而影响细胞的生物学特性［20-21］。MYC是重要的原癌基因，C-MYC在细胞周期中起重要调控作用，影响细胞增殖、分化和凋亡，其表达水平与癌细胞增殖程度有关［22］。C-MYC的异常激活具有促进细胞分裂和增殖的作用，从而参与宫颈癌的发生发展过程［23］。本研究结果显示，E1/CCAT1的表达水平随着宫颈病变程度的加重而呈升高趋势，且E1/CCAT1同C-MYC的表达高度正相关，表明HPV整合会影响临近的基因，最常受影响的基因就是MYC基因。CCAT1位于MYC基因上游可增强C-MYC的表达，过表达的CCAT1不仅具备其内源分子的特性，还使得MYC基因表达上调，并明显促进了肿瘤生长。陈玲玲等［24］发现，顺式过表达的CCAT1不仅具备其内源分子的特性，还可上调MYC基因表达，明显促进肿瘤生长，表明CCAT1可以调控其下游相近的MYC基因表达，在肿瘤发生中起着一定作用。

本文在宫颈上皮细胞中共验证105例，阳性10例，阳性率约为9.5%。结果表明，并不是所有HPV18感染的患者都存在HPV-host整合，可能只有约10%的患者有必要再行阴道镜检查。阳性结果的出现表明，融合转录本在宫颈病变过程中具有一定作用，而阳性率的升高更加表明HPV18整合产生的融合转录本与宫颈病变密切相关。因为仅有少数高危HPV感染最终发展成为宫颈癌，所以采用与宫颈细胞癌变密切相关的融合转录本作为宫颈癌初筛指标可能优于单纯采用高危型HPV感染作为后继阴道镜检查的指针。HPV整合宿主基因形成融合转录本可能成为宫颈癌筛查的新指标，E1/CCAT1融合转录本具备成为反映宫颈癌病变标志物的潜能。由于融合转录本检测能够缩小宫颈癌目标人群范围，还可以避免过度医疗造成的医疗资源浪费，降低医保资金的支出。

综上所述，高危HPV与宿主染色体的整合是宫颈癌癌前病变向宫颈癌进展的关键步骤，HPV整合位点附近宿主基因组的表达变化及整合后病毒癌基因的表达增强可能是宫颈癌发病的重要导火索。本研究所测得的融合转录本极有可能是通过调控CCAT1基因组的表达而发挥其在宫颈癌病变中的作用，具体机制有待进一步研究。