川芎嗪联合丹参多酚酸对家兔的抗凝血作用及其机制

黄枫铭 周启杨 夏睿思 胡元 李琳 岳明 饶芳 方燕 储利胜 潘小平*

川芎嗪为川芎活性成分，其通过拮抗钙离子、降低血液粘稠度、抑制血小板聚集等发挥抗血栓作用［1］，临床上应用川芎嗪注射液治疗急性脑梗死疗效显著［2］。丹参的有效水溶性成分为丹酚酸类，注射用丹参多酚酸具有通络活血的作用，可改善缺血性脑梗死患者的临床症状［3］。现代药理研究表明，川芎丹参配伍可以抗凝血、抑制血栓形成以及预防动脉粥样硬化的发生，对于治疗脑缺血、脑梗死等瘀血阻滞疾病有较好的疗效［4］。丹参川芎嗪注射液的主要成分为盐酸川芎嗪和丹参素，二者配比为50：1，通过抗血小板聚集降低血液粘稠度，发挥抗凝血作用，能够有效预防脑血栓的发生和形成［5］，改善微循环、抗心肌缺血的作用［6］。目前，关于川芎与丹参体外抗凝血作用的最佳配比以及是否能够抑制组织因子活性未见报道。本研究以家兔体外血液为实验对象，探索川芎、丹参的活性成分川芎嗪、丹参多酚酸体外抗凝血作用的最佳配比以及二者拮抗组织因子凝血作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性实验家兔8只，购自浙江中医药大学动物实验中心。

1.2 实验器材 烧杯若干，试管若干，20 mL量筒，10 μL、100 μL、1000 μL移液器（大龙兴创实验仪器股份公司）。

1.3 实验试剂 川芎嗪注射液（国药准字H22025223，广东星昊药业有限公司），注射用丹参多酚酸（国药准字Z20110011，天津天士力之骄药业有限公司），丹参川芎嗪注射液（国药准字H22026448，吉林四长制药有限公司），20 %氨基甲酸乙酯，生理盐水。肺组织浸出液制备：取新鲜完整兔肺，剪成小块后用生理盐水冲洗表面血液，将其碾磨成糊状，加入10倍量约50 mL生理盐水，置于2 ℃冰箱静置24 h后过滤，即得肺组织浸液。保存于-20 ℃冰箱冷冻室，实验前1 h取出融化备用。

1.4 实验方法 （1）家兔颈总动脉取血：家兔用20 %氨基甲酸乙酯麻醉后进行气管插管、颈动脉插管后用动脉夹夹闭颈总动脉近心端，准备烧杯，每次经颈总动脉取血5～6 mL。（2）川芎嗪的抗凝最适浓度选择：取5支试管并编号，每组试管分别加入生理盐水、川芎嗪注射液（终浓度为0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL）。经颈总动脉取血5 mL后，分别快速向每组试管加入1 mL新鲜血液，混匀后开始计时，每隔15 s将试管倾斜一次，至倾斜试管血液不再流动时停止计时，以上操作重复4次，记录凝血时间，确定川芎嗪抗凝最适浓度。（3） 川芎嗪与丹参多酚酸的抗凝最佳配比探究：基于以上选择剂量，另取1只家兔进行颈总动脉插管，取7支试管并编号，每组试管分别加入生理盐水、丹参川芎嗪注射液（终浓度0.102 mg/mL，其中川芎嗪终浓度0.1 mg/mL）、川芎嗪注射液（终浓度0.1 mg/mL），丹参多酚酸注射液（终浓度0.1 mg/mL）、川芎嗪注射液（终浓度0.1 mg/mL）与丹参多酚酸注射液（终浓度0.1 mg/mL）分别按1：1、1：2、1：3配比，以上操作重复4次，记录凝血时间，确定川芎嗪与丹参多酚酸抗凝最佳配比。（4）探究川芎与丹参配伍对组织因子的影响：基于以上确定的川芎嗪与丹参多酚酸最适配比，另取1只家兔进行颈总动脉插管，取6支试管并编号，每组试管分别加入生理盐水、肺组织浸出液、肺组织浸出液与丹参川芎嗪注射液（终浓度0.102 mg/mL）、肺组织浸出液与川芎嗪注射液（终浓度0.1 mg/mL）、肺组织浸出液与丹参多酚酸注射液（终浓度0.1 mg/mL）、肺组织浸出液与川芎丹参1：2最佳配比，以上操作重复4次，记录凝血时间。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度川芎嗪对正常家兔血液凝固的影响 生理盐水对照组平均凝血时间为（395.7±17.2） s。加入川芎嗪注射液（终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL）后，各组平均凝血时间分别为（543.7±20.3）s、（429.7±17.9）s、（351.0±80.6）s、（403.7±127.7）s。结果表明，与生理盐水对照组比较，川芎嗪浓度为0.1 mg/mL时，家兔的血液凝固时间最长（P＜0.01），即川芎嗪抗凝最适浓度为0.1 mg/mL。见表1。

表1 不同浓度川芎嗪对正常家兔凝血时间的影响［n=4，（±s）］

表1 不同浓度川芎嗪对正常家兔凝血时间的影响［n=4，（±s）］

注：与生理盐水对照组比较，#P＜0.01

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2.2 川芎嗪联合丹参多酚酸对正常家兔血液凝固的影响 生理盐水对照组平均凝血时间为（730.3±21.2）s。与生理盐水对照组相比，丹参川芎嗪阳性对照组中，加入丹参川芎嗪注射液（终浓度为0.102 mg/mL）后，平均凝血时间显著延长，为（856.0±24.9）s（P＜0.05）。与丹参川芎嗪阳性对照组比较，川芎嗪组加入川芎嗪注射液（终浓度为0.1 mg/mL），平均凝血时间为（803.3±3.5）s（P＜0.05）。丹参多酚酸组加入丹参多酚酸注射液（终浓度为0.1 mg/mL），平均凝血时间为（788.7±89.5）s。加入川芎嗪注射液（终浓度为0.1 mg/mL）配伍丹参多酚酸注射液（终浓度分别为0.1、0.2、0.3 mg/mL）后，平均凝血时间分别为（744.3±7.1）s（P＜0.05）、（901.0±7.5）s（P＜0.05）、（801.7±9.1）s（P＜0.05）。结果表明，川芎嗪与丹参多酚酸1：2配比时，样本凝血时间均值最大，即川芎嗪与丹参多酚酸最佳配比为1：2。见表2和图1。

表2 川芎与丹参配伍对正常家兔血液抗凝试验结果［n=4，（±s）］

表2 川芎与丹参配伍对正常家兔血液抗凝试验结果［n=4，（±s）］

注：与生理盐水对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与丹参川芎嗪对照组，▲P＜0.05

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图1 川芎与丹参配伍对正常家兔血液抗凝试验结果

2.3 川芎嗪联合丹参多酚酸抑制组织因子的促凝血作用 生理盐水对照组平均凝血时间为（536.3±10.0）s。与生理盐水对照组比较，组织因子对照组凝血时间显著缩短，平均凝血时间为（120.7±4.7）s（P＜0.01）。与组织因子对照组比较，在肺组织浸出液中加入丹参川芎嗪注射液（终浓度为0.102 mg/mL），凝血时间显著延长，平均凝血时间为（178.3±6.7）s（P＜0.01），对组织因子的抑制率为47.7 %。与丹参川芎嗪阳性对照组比较，在肺组织浸出液中分别加入川芎嗪注射液（终浓度为0.1 mg/mL）、丹参多酚酸注射液（终浓度为0.1 mg/mL）、川芎嗪注射液（终浓度为0.1 mg/mL）配伍丹参多酚酸注射液（终浓度为0.2 mg/mL）后，平均凝血时间分别为（139.3±2.5）s（P＜0.01）、（201.0±13.1）s、（238.3±3.5）s（P＜0.01），对组织因子的抑制率分别为15.4 %、66.5 %、97.4 %。结果表明，川芎嗪与丹参多酚酸1：2配比时，对组织因子的抑制作用最强，优于丹参川芎嗪注射液，且二者联合的抑制作用优于川芎嗪或丹参多酚酸的单独抑制作用。见表3和图2-3。

表3 川芎与丹参配伍对组织因子的影响试验结果［（±s），n=4］

表3 川芎与丹参配伍对组织因子的影响试验结果［（±s），n=4］

注：与生理盐水对照组比较，△P＜0.01；与组织因子对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01；与丹参川芎嗪对照组比较，▲P＜0.01

组别 试剂 新鲜血液（mL）凝血时间（s）抑制率（%）生理盐水对照组 生理盐水 1 536.3±10.0组织因子对照组 生理盐水+肺组织浸出液 1 120.7±4.7△0丹参川芎嗪对照组 丹参川芎嗪0.102 mg/mL+肺组织浸出液 1 178.3±6.7#47.7川芎嗪组 川芎嗪0.1 mg/mL+肺组织浸出液 1 139.3±2.5*▲15.4丹参多酚酸组 丹参多酚酸0.1 mg/mL +肺组织浸出液 1 201.0±13.1#66.5川芎丹参1：2组 川芎丹参1：2+肺组织浸出液 1 238.3±3.5#▲97.4

图2 川芎与丹参配伍对组织因子的凝血时间影响结果

图3 川芎与丹参配伍对组织因子抑制作用

3 讨论

川芎为药用植物川芎干燥的根茎，具有活血祛瘀、止痛祛风的功效［7］。血府逐瘀汤、通窍活血汤中应用川芎以起到通络散瘀的作用［8-9］。丹参为唇形科植物丹参的根，具有凉血消痈、镇静安神之功［10］。《太平圣惠方》独活散中加入川芎、丹参以开郁行气、活血化瘀。利脑心胶囊、通脉颗粒等复方中成药的主要成分均为川芎、丹参［11］。川芎、丹参是中医临床常用的一组活血药对，其活性成分分别为川芎嗪与丹参多酚酸，二者在体内外均有较强的抗凝血活性。川芎嗪在体外被证实可以延长凝血酶原时间（PT）、部分凝血活酶时间（APTT）以及凝血酶时间（TT）［12］，与本实验结果川芎嗪能够延长体外凝血时间的趋势一致。据研究报道，丹参多酚酸的主要活性成分丹酚酸B、紫草酸可显著延长APTT［13］。主要由川芎、丹参提取物等组成的降圣脑康汤，可延长PT、APTT、TT［14］，提示两者联用具有协同抗凝血作用。本研究发现，川芎嗪与丹参多酚酸配比为1：2时的抗凝血效果最佳，而且两者联合的抗凝血效果优于单独作用，可能与两者共同影响凝血酶原活性或抑制血小板聚集有关。在体内，川芎嗪可通过降低黏附分子vWF与纤维连接蛋白的水平，进而抑制血小板与血管内皮细胞的黏附能力，改善血流循环［15］。此外，川芎嗪与丹参多酚酸在体内均可通过抗血小板聚集、抑制组织因子合成进而发挥抗凝血的作用［1，11，16-17］，但在体外两者是否能够直接抑制组织因子的促凝血作用，未见报道。成春英等［16］研究表明，川芎嗪可在mRNA水平上抑制血管内皮细胞表达组织因子。丹参多酚酸的主要活性成分丹酚酸B，能够通过降低组织因子在动脉粥样斑块内的表达抑制血栓形成［17］。丹参川芎嗪联合低分子肝素可下调肺栓塞大鼠组织因子水平［18］。川芎嗪与丹参多酚酸在体内可以通过抑制组织因子表达从而发挥抗凝血作用［16-18］。根据本实验结果可以初步判定，川芎嗪与丹参多酚酸配伍对组织因子体外促凝血活性存在一定拮抗作用，且川芎、丹参1：2配伍的抗凝血作用优于单独使用。在外源性凝血途径中，组织因子与FⅦa在Ca2+辅因子存在下结合形成FⅦa-组织因子复合物，一方面直接激活FⅩ生成FⅩa，另一方面通过激活FⅨ间接激活FⅩ，同时FⅨa通过正反馈作用活化FⅦ，最终活化的Ⅹa结合Ca2+与FⅤa共同形成凝血酶原酶复合物［19］。因此，川芎嗪与丹参多酚酸配伍起到增效抗凝血作用的机制，可能与抑制组织因子活性，进而抑制FⅦa-组织因子复合物的形成有关。后续可通过测定FⅦa-组织因子复合物及其他凝血因子含量的变化以进一步揭示其潜在机制。

本研究结果显示，川芎嗪与丹参多酚酸1：2配比的凝血时间较丹参川芎嗪对照组显著延长，而且1：2配比对组织因子的抑制率达97.4 %，明显高于丹参川芎嗪对照组（47.7 %）。说明川芎嗪与丹参多酚酸1：2配比的体外抗凝血效果优于临床使用的丹参川芎嗪注射液（川芎嗪：丹参素为50：1），而且对组织因子抑制作用更强，可能与增加丹参多酚酸比例有关，但同时存在成本高、容易发生出血等并发症的问题。冠心病、脑梗死等的常规治疗多采用降脂、抗凝、溶栓等相应药物治疗，并发症的发生率较大，存在一定局限性［6，20］。本研究对于探究川芎嗪与丹参多酚酸最佳配比治疗心脑血管疾病具有潜在的价值，川芎嗪与丹参多酚酸通过降低血液粘稠度、改善循环、抑制血栓形成，辅助治疗心脑血管疾病，具有不良反应少、安全性好等优势［21-22］。不过，川芎嗪与丹参多酚酸配伍的抗凝血机制还有待进一步探讨，后续可针对凝血因子、凝血酶原酶复合物开展研究，为临床应用及新药研发提供理论依据。