BIRC3在TNF-α诱导血管平滑肌细胞表型转化中的作用

郝中伟 刘祖秋 李红敏 胡岩松 罗学胜

血管平滑肌细胞（VSMC）是动脉血管的主要组成部分，病理条件下VSMC会由“收缩型”向“合成型”转化，表现为收缩相关蛋白表达下降，细胞外基质成分的分泌活跃，迁移、侵袭能力增强［1］。炎症因子可诱导VSMC发生表型转化［2］，进而参与动脉粥样硬化、血管支架置入术后再狭窄等疾病的发生发展［3-4］。肿瘤坏死因子α（TNF-α）在高血压、动脉粥样硬化患者外周血中显著升高，硬化斑块组织中也能检测到TNF-α的高水平富集［5-7］。基础研究发现，TNF-α可通过诱导VSMC表型转化参与动脉重塑［8］、泡沫细胞形成［9］、新生内膜增生［10］等病理过程。本研究旨在探索TNF-α诱导VSMC表型转化的关键信号分子，并通过细胞拯救实验验证靶向该分子能否阻断TNF-α对VSMC表型的影响。

1 材料与方法

1.1 转录组测序数据下载和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）从基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）下 载GSE115311转录组测序表达矩阵，从中提取来自TNF-α处理的VSMC（GSM3175352、GSM3175353）和 正 常VSMC（GSM3175354、GSM3175354）的RNA-seq结果。利用GSEA软件（4.1.0版），选择MSigDB库中c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt基因集进行富集分析。显著富集标准为校正后的富集分数（normalized enrichment score，NES）绝对值>1.0，错误发现率（false discovery rate，FDR）<25%，且P<0.01。

1.2 细胞培养 人主动脉平滑肌细胞购自Gibco公司，于添加平滑肌细胞生长添加剂的231培养基中培养传代，37 ℃、5% CO2环境条件。取第3～6代细胞进行实验。

1.3 细胞处理及分组 取对数生长期的VSMC，经2%胎牛血清预处理24 h后进行实验。在12孔板中加入10 ng/mL 的TNF-α（abcam公司），分别处理0 h、12 h、24 h和48 h，用于检测杆状病毒IAP重复序列3（baculoviral IAP repeat-containing 3，BIRC3）的mRNA和蛋白表达。在6孔板中，采用lipofectamine 2000试剂盒，分别将BIRC3特异性干扰RNA（siBIRC3）和阴性对照干扰RNA（siNC）转入细胞。转染24 h后，再用TNF-α（10 ng/mL）处理两组细胞，用于后续实验。

1.4 实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR） Trizol法提取总RNA。根据逆转录试剂盒（TaKaRa公司）步骤合成cDNA。按照SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（TaKaRa公司）步骤配制20 μL反应体系进行qRT-PCR反应，每个样本设3复孔。实验所用的引物序列：BIRC3上游引物：5'-TTTCCGTGGCTCTTATTCAAACT-3'，下游引物：5'-GCACAGTGGTAGGAACTTCTCAT-3'；α-SMA上游引物：5'-GTGTTGCCCCTGAAGAGCAT-3'，下游引物：5'-GCTGGGACATTGAAAGTCTCA-3'；MYH11上游引物：5'-CGCCAAGAGACTCGTCTGG-3'，下游引物：5'-TCTTTCCCAACCGTGACCTTC-3'；GAPDH上 游 引物：5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'，下游引物：5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。

1.5 蛋白免疫印迹（western blot，WB）检测 用SDS裂解液充分裂解细胞，4 ℃、10,000 r/min离心10 min，取上清，获得总蛋白。BCA法测定上清液浓度，上样缓冲液配平各个样品致使每孔上样30 μg蛋白。经12%SDS-PAGE凝胶电泳后，转膜至PVDF上。WB封闭液（上海碧云天生物技术有限公司）室温封闭1 h，4 ℃下孵育一抗过夜。TBST洗涤3次，室温下孵育二抗1 h。TBST洗涤后，采用增强型化学发光试剂（ECL）进行显影，成像后使用Image J软件定量蛋白质条带。

1.6 平板划线实验 使用200μL移液器枪头在各组细胞的6孔培养板板底中央做出划痕，无菌PBS缓冲液洗涤去除细胞残渣。分别在划痕后0 h和24 h取样拍照，以0 h的细胞划痕宽度为基准，计数24 h后迁移至划痕内的细胞个数，作为迁移能力的定量指标。

1.7 Transwell检测 采用无血清培养液稀释的Matrigel包被Transwell上室后，置于室温下干燥凝固。重悬并调整各组细胞浓度致1×105个/mL。取200μL细胞悬液接种于Transwell上室中，下室中加入500 μL含有10%胎牛血清的培养基，培养24 h后去除小室。吸去培养液后，用棉签轻轻擦去小室上层细胞，PBS缓冲液洗涤后，采用4%多聚甲醛固定，再用0.1%结晶紫染色10 min，显微镜下随机选取3～5个视野拍照，并进行细胞计数。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism 6统计软件。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转录组测序的基因集富集分析 GSEA分析发现，NOD-like受体信号通路（P<0.001，NES=1.64，FDR=0.056）相关基因在TNF-α刺激的VSMC中明显富集，见图1A。其中，BIRC3基因的表达在TNF-α处理组中显著上调（logFC=6.3，P<0.01），见图1B。

2.2 TNF-α上调VSMC中BIRC3的表达 为明确TNF-α对BIRC3表达的影响，分别以10 ng/mL的TNF-α处理VSMC细胞0 h、12 h、24 h和48 h。定量PCR结果提示，TNF-α对BIRC3 mRNA的促表达作用呈时间梯度依赖性。TNF-α处理12 h后，BIRC3的mRNA水平已显著高于对照组（2.90±0.12，P<0.01），24 h后的表达水平则进一步上调（5.45±0.16，P<0.01），见图2A。Western Blot结果提示，TNF-α能够显著上调BIRC3蛋白在VSMC中的表达，见图2B。

图2 TNF-α对VSMC中BIRC3表达的影响

2.3 干扰BIRC3表达逆转TNF-α对VSMC收缩表型标志物的抑制作用 TNF-α刺激VSMC的同时干扰敲低BIRC3。定量PCR结果提示，siBIRC3组中MYH11（2.43±0.18，P<0.01，见图3A）和α-SMA（2.57±0.13，P<0.01，见图3B）的mRNA表达水平均显著高于对照组。Western Blot结果进一步发现，与对照组比较，siBIRC3组中MYH11和α-SMA蛋白表达明显升高（见图3C），提示敲低BIRC3表达能够阻断TNF-α对VSMC收缩表型标志物的抑制作用。

图3 干扰抑制BIRC3对TNF-α处理的VSMC中收缩表型标志物的影响

2.4 干扰敲低BIRC3对TNF-α诱导VSMC迁移的影响 平板划线实验结果提示，与对照（siNC）组（68.50±7.53）比较，siBIRC3组细胞的迁移能力（51.0±4.56）显著减弱，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。

图4 干扰抑制BIRC3对TNF-α处理的VSMC迁移的影响

2.5 干扰BIRC3表达减弱TNF-α对VSMC的促侵袭作用 Transwell侵袭实验结果如图5所示，TNF-α刺激VSMC的同时干扰敲低BIRC3能够显著减弱细胞的侵袭能力（25.83±4.27），与对照（siNC）组（44.83±4.15）比较，差异有统计学意义（P<0.01）。

图5 干扰抑制BIRC3对TNF-α处理的VSMC侵袭能力的影响

3 讨论

慢性炎症反应介导的VSMC表型转化是许多疾病共同的病理基础之一［11］，心血管疾病的发病机制错综复杂，TNF-α作为引起血管炎症反应的重要因子，可通过多途径参与调控VSMC表型转化［12］。本研究筛选验证，BIRC3基因的表达在TNF-α处理的VSMC中显著上调，并通过拯救实验证明BIRC3是TNF-α诱导VSMC表型转化的关键环节分子。BIRC3，又称细胞内抑制凋亡蛋白2（cIAP2），是细胞凋亡抑制蛋白家族中的一员，其N末端含有3个相连的杆状病毒IAP重复结构域（BIR），C末端含有一个指环RING结构域，具有E3泛素连接酶活性。ZHOU等［13］研究表明，TNF-α可促进多种不同类型细胞中BIRC3的表达。本研究也发现，TNF-α能够显著上调BIRC3在VSMC中的表达，提示该作用在不同种类细胞间具有一定的保守性。

从蛋白功能角度来看，当TNF-α作用于细胞时，BIRC3的BIR结构域与肿瘤坏死相关因子1、2（TRAF1，TRAF2）形成复合物，并被招募至肿瘤坏死因子受体附近，通过激活NF-κB经典通路影响下游基因的表达，而BIRC3又是受NF-κB正向调控的基因之一［14］。由此可见，TNF-α/BIRC3/NF-κB在胞内可形成正反馈环路，放大TNF-α对细胞的影响［15］。既往研究亦表明，TNF-α/NF-κB是介导VSMC表型转化的关键通路［12］。据此推测，抑制BIRC3的表达或许能够阻断TNF-α对VSMC表型的影响。本研究在TNF-α处理VSMC的同时，利用干扰RNA敲低BIRC3的表达，结果显示BIRC3表达下降能够显著阻断TNF-α对α-SMA和MYH11等收缩表型标志物的抑制作用，并且能够有效抑制TNF-α对VSMC迁移的促迁移作用。大量研究表明，慢性炎性刺激可促使发生表型转化的合成型VSMC分泌基质金属蛋白酶，降解细胞外基质，导致其侵袭性迁移，这也是PCI术后再狭窄等许多心血管疾病发生发展的重要细胞学机制［16］。本研究进一步Transwell实验发现，抑制VSMC中BIRC3的表达可以有效阻断TNF-α诱导的细胞侵袭。

综上，TNF-α可上调VSMC中BIRC3的表达，抑制BIRC3能够有效阻断TNF-α诱导的VSMC表型转化，为治疗慢性血管炎症反应提供新的潜在靶点，但鉴于BIRC3功能的多样性，其对VSMC表型调控的具体机制有待于进一步研究。