丹酚酸A诱导小鼠白色脂肪组织褐变改善肥胖

来建飞 钱倩宇 丁秦超 李松涛 窦晓兵 陈林 朱林文思

肥胖已成为世界范围内导致人类死亡的第五大因素，并可引起许多并发症［1-2］。丹酚酸A（Sal A）是丹参中的水溶性天然多酚类化合物单体，具有抗氧化、抗炎症、促进脂肪酸代谢等多种药理特性及作用［3-6］。白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）是哺乳动物体内两种主要的脂肪组织［7-9］。外界药物或寒冷刺激诱导可降低小鼠体重增加并刺激小鼠WAT褐变，增加棕色脂肪细胞标记基因（UCP1、PRDM16、PGC-1α、AMPK、Cidea）的表达［10-12］。本实验室研究发现，腹腔注射丹酚酸A可诱导小鼠脂肪组织中UCP1和PGC-1α等蛋白高表达，从而逆转高脂高糖饮食诱导的肥胖。本文从体内实验明确Sal A促进脂肪细胞褐变的作用，为以Sal A为主治疗肥胖症的老药新用研发提供新思路，对解决肥胖问题具有潜在价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料 （1）仪器：倒置显微镜，日本OLMPUS公司，型号CKX31；微量紫外分光光度仪，美国Quawell公司，型号QWell 5000；台式高速冷冻离心机，德国Beckman公司，型号5541RB31614；垂直电泳槽，美国 Bio-Rad 公司，型号 Mini PROTEAN® Tetra Cell；电泳仪，美国Bio-Rad公司，型号Power Pac；TMHC制冰机，浙江宁波格兰特公司，型号XB-100；电子精密天平，美国Ohaus，型号AR1140。（2）材料：丹酚酸A，成都德思特生物技术有限公司，货号：96574-01-5；生理盐水，美国Sigma公司，货号：S0817；普通固体饲料，美国Open Source Diet 公司，货号：D12450B；标准高脂肪固体饲料，美国Open Source Diet 公司，货号：批号D12492。Anti-UCP1 Antibody，美国Abcam公司，货号：ab10983；Anti-PGC-1α Antibody美国Abcam公司，货号：ab43003；Anti-GAPDH antibod，武汉博士德生物技术有限公司，货号：A00227；Goat anti-Mouse IgG antibody，武汉博士德生物技术有限公司，货号：BA1050。

1.2 实验方法 （1）动物造模及组织样本处理：将40只雄性C57BL/6小鼠置于（23±2）℃恒温环境中喂养8周，可自由取食、饮水，光照/黑暗周期为12 h。小鼠适应喂养环境后随机分为4组，每组10只，即正常饮食组（ND组，腹腔注射生理盐水溶液），高脂高糖饮食组（HFD组，腹腔注射生理盐水溶液），高脂高糖饮食与腹腔内注射20 mg/kg Sal A组（HFD-LS组），高脂肪和高碳水化合物饮食与腹腔内注射40 mg/kg Sal A组（HFD-HS组）。前2周，实验老鼠均被喂食常规鼠粮；2周后，HFD组和Sal A处理组的小鼠均改为高脂高糖饮食8周。实验结束后，所有小鼠均被处死，收集附睾脂肪并储存于-80 ℃冰箱。

1.3 观察指标 （1）小鼠的体重与每日食物摄入量：喂养期间，每周测量一次体重。（2）组织形态学观察：附睾的脂肪样本切成段（10 μm）使用Leica 低温恒温器，然后用苏木精和伊红染色（圆）可视化附睾的白色脂肪组织（eWAT）中脂肪细胞的大小，使用显微镜观察4个随机选择的区域内细胞数量（100×100 μm），计算平均值。（3）基因与蛋白检测：取适量小鼠附睾脂肪组织在冰上剪碎并置于试管中，分别提取RNA与蛋白质，进一步采用实时定量荧光PCR（RT-PCR）检测脂肪组织内棕色化相关基因的表达水平，采用蛋白质印迹法（Western Blot）检测脂肪组织内UCP1和PGC-1α的蛋白表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料符合正态分布，以（±s）表示，采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组小鼠的体重、每日食物摄取量比较 HFD-LS组和HFD-HS组的小鼠体重均明显小于HFD组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 A.四组小鼠体重增长比较，#P＜0.05，★P＜0.05；B.四组小鼠每日食物摄取量比较

2.2 四组小鼠的附睾脂肪组织形态学观察和附睾脂肪重量比较 见图2。

图2 A.附睾脂肪组织形态学照片；B.附睾脂肪组织重量；与ND组比较，#P＜0.05；与HFD组比较，★P＜0.05

2.3 四组小鼠附睾脂肪组织H&E染色结果比较 Sal A可减轻肥胖小鼠附睾脂肪细胞中的脂肪过度积累，见图3。

2.4 四组小鼠附睾脂肪组织内棕色化相关基因的表达水平比较 Sal A可促使肥胖小鼠附睾脂肪中棕色脂肪细胞标志基因（UCP1、PRDM16、PGC-1α、AMPK、Cidea）高表达。见图4。

2.5 四组小鼠附睾脂肪组织内UCP1和PGC-1α的蛋白表达水平比较 Sal A可促使肥胖小鼠附睾脂肪中UCP1和PGC-1α蛋白高表达，见图5。

图3 A.四组小鼠附睾脂肪组织H&E染色eWAT中脂肪细胞大小（100 μM）；B.四组小鼠附睾脂肪组织H&E染色切片的细胞数量/单位面积；与ND组比较，#P＜0.05；与HFD组比较，★P＜0.05

图4 四组小鼠附睾脂肪组织内棕色化相关基因的表达水平比较；与ND组比较，#P＜0.05；与HFD组比较；★P＜0.05

图5 四组小鼠附睾脂肪组织内UCP1和PGC-1α的蛋白表达水平比较；与ND组比较，#P＜0.05；与HFD组比较；★P＜0.05

3 讨论

最新研究进展表明，某些药理食材成分可促进哺乳动物增加能量消耗，减少脂肪堆积，促进白色脂肪褐变。本课题组初步试验采用长期高脂高糖饮食喂养建立C57BL/6小鼠肥胖病模型。初步实验结果表明，丹酚酸A干预可逆转C57BL/6小鼠由高脂高糖饮食诱导的肥胖，且具有预防肥胖的作用。WANG等［13］研究表明，丹酚酸A可通过激活AMPK和线粒体改善肥胖相关疾病症状。然而，目前尚未有从促进脂肪细胞产生热量来增加能量消耗即褐色化方面来探讨丹酚酸A治疗多种肥胖相关疾病发生发展的机制研究。查阅大量国内外相关文献后，本课题组首次开展研究Sal A对HFD小鼠肥胖与WAT褐变的影响。笔者在C57BL/6小鼠中测试Sal A腹腔注射对HFD诱导的肥胖的影响，结果见图2。通过测量小鼠附睾脂肪组织的eWAT质量来评估HFD诱导的脂肪过度积累，结果显示与HFD组相比，HFDLS组和HFD-HS组小鼠的体重明显降低，HFD组的附睾脂肪重量显著减轻，且在食物摄入量上没有差异。由此可见，在C57BL/6小鼠上Sal A具有预防高脂高糖饮食引起的肥胖的作用。C57BL/6小鼠附睾脂肪组织H&E染色eWAT中脂肪细胞大小比较，经Sal A处理的小鼠附睾脂肪组织内的脂肪细胞更小。

肥胖的特征是脂肪异常沉积，因此有必要研究脂肪组织中基因或蛋白质的变化。为了进一步探讨Sal A预防肥胖的可能机制，本研究检测分析与WAT褐变相关的基因和蛋白，结果表明Sal A可在基因水平上促进WAT中棕色脂肪细胞标记基因（UCP1、PRDM16、PGC-1α、AMPK、Cidea）的高表达，Sal A显著增加小鼠脂肪组织中UCP1和PGC-1α的mRNA和蛋白表达水平。UCP1是一种产热蛋白，在BAT中大量表达，WAT中UCP1表达的增加诱导了米色脂肪细胞的形成［14］。为进一步确定Sal A对小鼠附睾脂肪组织棕色化水平的调节作用，笔者又进行蛋白水平的实验研究，结果发现高脂高糖饮食诱导会造成小鼠脂肪组织的产热标志蛋白UCP1表达下降，而注射Sal A的小鼠附睾脂肪组织中UCP1和PGC-1α的蛋白表达水平较HFD组有显著升高。实验结果说明，Sal A可促使棕色脂肪细胞的标志蛋白UCP1在肥胖小鼠附睾脂肪中高表达；Sal A具有促进WAT褐变的能力，从而增加了能量消耗和产热。DESHMUKH等［15］指出，人的成年期也会发生褐变，这表明白色脂肪组织的褐变是一种很有希望的策略，可以预防和/或治疗肥胖和相关的共病，如2型糖尿病［16］。Sal A诱导WAT褐变增加能量消耗从而减少脂肪积累，达到预防肥胖疾病的作用。因此，Sal A可能是预防与治疗肥胖症及其代谢并发症的候选药物。