lncRNA PCAT-1在卵巢癌组织中的表达及其对卵巢癌细胞恶性生物学功能的影响

徐玉红 张慧雅 郑伟平 卢琪芸 阮雅文 陈君霞

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，在女性癌症相关死亡中占5%～6%。每年卵巢癌的全球新发病例超过23万，且有≥14万女性因卵巢癌死亡［1］。尽管手术及化疗被广泛应用于卵巢癌治疗，80%的患者发展为化疗耐药并转移，最终导致死亡［2］。研究表明，多种长链非编码RNA（lncRNA）在卵巢癌中表达失调，可作为卵巢癌的潜在治疗靶点［3-5］。前列腺癌相关长链非编码RNA转录产物1（PCAT-1）是近几年才被发现的人类癌症相关分子，在多种肿瘤疾病中被证实具有致癌作用［6-8］。本研究旨在探讨PCAT-1在卵巢癌组织中的表达及抑制PCAT-1表达对卵巢癌恶性生物学功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）标本与细胞株：收集2019年6月至2020年9月本院手术切除的卵巢癌组织20例，同时取癌旁正常组织20例，立即置于液氮保存，所有患者术前未进行任何辅助治疗，术后均经病理证实。该研究项目获本院医学伦理委员会同意，所有患者均于术前签署知情同意书。人卵巢癌SKOV3细胞株购自上海中国科学院细胞库。（2）主要试剂：胎牛血清，McCoy's 5A培养基，胰酶购自美国Gibco公司。TRIzol试剂、Lipofectamine 2000转染试剂购自invitrogen公司。逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。引物序列、小干扰RNA（si-RNA）均由上海吉玛制药公司设计合成。CCK-8购自MCE（MedChemExpress）公司，Transwell小室、Matrigel基质胶购自美国Corning公司，蛋白提取试剂RIPA及蛋白酶抑制剂购自碧云天公司，PARP1及β-actin一抗购自santa cruz公司。

1.2 方法 （1）荧光实时定量PCR：利用TRIzol试剂提取卵巢癌组织样本中的RNA，取1 μg的总RNA利用逆转录试剂盒反转录为cDNA，使用荧光定量PCR试剂盒进行qPCR。PCAT-1的引物序列上游5'-GACAAACCGCAACATCACCA-3'，下游 5'-GCTCCTCATCTTCAAGGCTCT-3'，GADPH 的引物序列上游5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'，下游 5'- AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。以GADPH为内参基因，采用2-△△ct法计算PCAT-1的相对表达量。（2）细胞培养及转染：细胞置于37 ℃含5% CO2的培养箱中，在含10%胎牛血清和1%双抗的McCoy's 5A培养基中培养，每隔1～2天更换培养基，当细胞汇合度达80%左右时进行传代。取对数生长期的细胞接种于6孔细胞培养板中，当细胞汇合度达60%～70%时，按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行小干扰RNA转染，分别转染si-PCAT-1和阴性对照si-NC，转染时为无血清培养液，6 h后换成含10%FBS的新鲜培养液。si-PCAT-1序列上游5'-GCUGAUCAUCUUACAACUATT-3'，下游 5'-UAGUUGUAAGAUGAUCAGCTT-3'，si-NC 序列上游5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3'，下游5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3'。采用RT-qPCR检测转染效果，方法同1.2.1。（3）CCK-8法：将两组对数生长期的细胞以1×103/孔铺于96孔板，于接种培养第6 h、24 h、48 h、72 h加入10 μl/孔CCK-8试剂，继续培养箱中培养1 h，酶标仪检测450 nm波长的光密度值。实验重复3次，取平均值。（4）细胞划痕实验：取接种于6孔板中的两组对数生长期细胞（融合度约90%），用200 μl灭菌枪头垂直划线，显微镜下测量划痕的初始距离，培养箱中继续孵育24 h、48 h和72 h后，测量划痕距离，并计算细胞的迁移率。细胞迁移率=［迁移距离（0 h）-迁移距离（24 h、48 h、72 h）］/迁移距离（0 h）。实验重复3次，取平均值。（5）Transwell侵袭实验：将Matrigel基质胶与5A培养液以1∶8比例稀释后混匀，加入到Transwell小室上室的底部膜上，放入培养箱中6 h以充分凝固。细胞转染24 h后，选择无血清培养液将细胞重悬调整密度为5×104/ml，取200 μl/孔加Transwell入培养板上室，将含10%血清的培养液以500 μl/孔加入Transwell培养板下室，培养箱中培养24 h后取出小室，棉签擦拭Transwell培养板上室中未穿过基底膜的SKOV3细胞，甲醇固定20 min，PBS清洗3次，0.1%结晶紫溶液染色30 min，PBS清洗3次。显微镜下随机选取5个视野计算穿过基底膜的SKOV3细胞数。实验重复3次，取平均值。（6）western blot：将转染后的两组SKOV3细胞培养至对数生长期，收集细胞并用RIPA裂解，提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。用SDS-PAGE分离蛋白，转PVDF膜，将膜放入5%脱脂奶粉的封闭液中封闭1 h，加入一抗PARP1（1∶1000）、β-actin（1∶1000）4 ℃过夜孵育，TBST洗膜后加入酶标二抗，室温孵育2 h，洗膜后加入发光液于凝胶成像系统中显影拍照。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCAT-1在卵巢癌组织中的表达 PCAT-1在卵巢癌组织中的表达量（3.66±0.47）高于癌旁组织（1.35±0.24），差异具有统计学意义（t=4.42，P＜0.01），见图1。

图1 PCAT-1在卵巢癌及正常癌旁组织中的表达

2.2 下调PCAT-1表达对SKOV3细胞增殖能力的影响 细胞转染si-PCAT-1和si-NC48 h后，si-PCAT-1组的PCAT-1表达量（0.23±0.03）显著低于si-NC组（1.00±0.12），差异有统计学意义（t=10.82，P＜0.01），见图2A。下调PCAT-1表达后，si-PCAT-1组48 h、72 h细胞增殖活性（0.92±0.05、1.56±0.08）较si-NC组（1.29±0.07、1.86±0.06）下降，差异具有统计学意义（t=9.32、t=6.68，P均 ＜0.01），见图2B。

图2 PCAT-1干扰效果及下调PCAT-1表达对SKOV3细胞增殖能力的影响

2.3 下调PCAT-1表达对SKOV3细胞迁移及侵袭能力的影响 划痕实验表明，与si-NC组（0.87±0.05）相比，si-PCAT-1组（0.72±0.05）的细胞迁移率在72小时后降低（t=3.9，P＜0.05），见图3。transwell侵袭实验表明，si-PCAT-1组（68.40±12.28）穿过Matrigel基质胶的细胞数量明显少于si-NC组（138.00±10.70），差异有统计学意义（t=9.56，P＜0.01），见图4。

2.4 下调PCAT-1表达对SKOV3细胞PARP1蛋白表达的影响 Western blot结果表明，si-PCAT-1组（0.41±0.07）PARP1蛋白表达水平较si-NC组（0.71±0.04）降低，差异具统计学意义（t=6.51，P＜0.01），见图5。

图3 下调PCAT-1表达对SKOV3细胞迁移袭能力的影响

图4 下调PCAT-1表达对SKOV3细胞侵袭能力的影响

图5 下调PCAT-1表达对SKOV3细胞PARP1蛋白表达量的影响

3 讨论

PCAT-1长约1.9 kb，由两个外显子构成，位于染色体8q24，原癌基因MYC上游725 kb处。最初是在前列腺癌中发现，其表达量升高促进前列腺癌进展并恶化。之后，PCAT-1被证实在多种癌症疾病中表达异常，通过影响细胞增殖、侵袭、转移、凋亡、细胞周期、同源重组等发挥致癌作用［9］。研究表明，PCAT1与骨肉瘤预后相关，可促进骨肉瘤细胞增殖，迁移，侵袭及上皮细胞-间质转化（EMT），骨肉瘤细胞中抑制PCAT-1使得停留在细胞周期G0/G1期的细胞增加，S期细胞减少［10］。在直肠癌相关研究中发现，下调PCAT-1显著抑制了细胞增殖，并诱发细胞周期捕获［11］。此外，PCAT-1还参与肿瘤化疗耐药。抑制PCAT-1表达可通过p38和MAPK信号通路抑制多发性骨髓瘤硼替佐米耐药［12］。PTEN是迄今为止发现的第一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，调控着细胞周期和多种信号途径，LI等［13］研究表明，PCAT-1可通过抑制PTEN促进胃癌顺铂化疗耐药。关于PCAT-1在卵巢癌中的表达及其相关分子机制，目前报道的文献较少。LIU等［14］研究表明，PCAT-1在卵巢癌组织中表达较癌旁组织升高，可能是通过下调抑癌基因KLF-6（kruppel like factor 6）参与卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭过程。本研究通过检测20例卵巢癌和癌旁组织发现，PCAT-1在卵巢癌组织中高表达，且抑制PCAT-1表达后卵巢癌SKOV3细胞的增殖、迁移及侵袭能力下降，说明PCAT-1在卵巢癌中存在致癌作用，可能通过调控卵巢癌细胞的生物学行为影响卵巢癌的进展。

PARP抑制剂作为卵巢癌患者化疗后的维持治疗药物，广泛应用于临床，可明显延长BRCA突变的铂敏感复发性高级别卵巢癌患者无进展生存期［15］。最新研究结果证实［16］，新诊断的携带BRCA1/2突变的高级别卵巢癌患者也可获益，与安慰组相比，PARP抑制剂维持治疗组疾病进展或者死亡风险降低70%。近年来，有文献报道认为，PCAT-1对PARP存在调控行为。在结肠癌细胞株中HT-29及Caco-2研究发现，抑制PCAT-1表达可致caspase-3、bax、PARP等清除率增加，并抑制了癌基因bcl-2表达［15］。此外，体内外研究结果均发现，PCAT-1可通过抑制BRCA2表达调节前列腺癌细胞对PARP1抑制剂的敏感性［17］，提示PCAT-1可能在PARP1抑制剂靶向治疗前列腺癌等肿瘤性疾病中具有辅助作用。关于卵巢癌细胞中PCAT-1对PARP1的调控作用目前尚未明确。本研究结果表明，抑制SKOV3细胞中PCAT-1表达后，PARP1蛋白表达水平下降，提示卵巢癌细胞中PCAT-1可能对PARP1存在着调控作用，但其具体的调控分子机制有待于进一步研究。