贝伐珠单抗在晚期非鳞非小细胞肺癌治疗中的相关血浆生物标志物研究

丁玲玉 江哲龙 莫丽钦 张珍 吴海鹰 潘月龙

血管内皮生长因子A（VEGF-A），贝伐珠单抗，在多种肿瘤中显示了较好的疗效［1］。不同的患者从贝伐珠单抗治疗获益与否以及获益的程度均不一样，目前有急切的需求来筛选出最有可能获益的患者。至今均未确定一个在临床中能应用的有预测疗效的标志物。未经选择的非鳞非小细胞肺癌患者，一线化疗或后线化疗的基础上联合贝伐珠单抗显示了更好的疗效和更长的生存时间［2-3］。在非小细胞肺癌开展过一些标志物的研究，包括VEGF 配体和受体（VEGFRs）、成纤维生长因子（FGF）等［4-5］。关于血浆标志物的预测作用不同的研究数据大不相同。虽然贝伐珠单抗阻断了VEGF 通路，但血管生成的错综复杂常导致了耐药的产生。动物模型显示肿瘤细胞或间质细胞表达的粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是抗VEGF 治疗耐药的一个决定因素［6］。本研究旨在探索在非小细胞肺癌中，血浆标志物和贝伐单抗联合化疗有效率（ORR）之间的关系。主要研究终点为ORR 和基线VEGF-A、VEGFR-2 和G-CSF 水平的相关性。次要研究终点包括无疾病进展时间（PFS）和基线血浆标志物相关性，血浆标志物的动态变化。

1 材料与方法

1.1 研究设计 该研究是在中山大学附属肿瘤医院进行的一个单臂II 期临床研究。入组标准：转移性非鳞非小细胞肺癌患者；年龄＞18 岁；美国东部肿瘤协作组（ECOG）体能状态（PS）评分0～2 分；存在实体肿瘤疗效评价标准（RECIST）1.1 版可评估的病灶；充足的血液、肝肾储备功能。排除标准：组织学为鳞状细胞癌；＞2 级咯血；不能有效控制的高血压；有症状的中枢神经系统转移。研究方案获得了中山大学肿瘤医院的伦理委员会审查、通过。该试验严格遵从赫尔辛基宣言。所有患者均签署了书面知情同意书。

1.2 研究方案 符合入组标准的患者进行每3 周静脉注射7.5mg/kg 贝伐单抗，剂量参照AVAPERL 研究［2］。根据研究者决定，化疗方案为每3 周静脉注射500mg/m2培美曲赛或联合75mg/m2顺铂。培美曲赛、顺铂联合贝伐单抗最多给予6 周期，获得缓解或稳定的患者继续给予培美曲赛联合贝伐单抗维持治疗，直到疾病进展或不可耐受的副作用。

1.3 标志物样本收集 在基线和2 周期治疗后，用乙二胺四乙酸（EDTA）管采集5ml 患者外周血标本。采血30min 内予1000r/min 低温离心15min。随后，取上清液（血浆）储存在-80℃冰箱，在分析前避免冻融。

1.4 标志物分析方法 选取VEGF-A、VEGFR-2 和G-CSF 为该研究的候选血浆标志物。标本送到广州金域检验中心进行检测。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，美国Quantikine 研发系统试剂盒进行检测。

1.5 疗效和安全性评价 在基线及每2 周期治疗后进行高分辨CT 扫描评价肿瘤大小。采用RECIST 1.1 版缓解评估缓解率。采用国家癌症研究所不良事件的通用术语标准（NCI-CTCAE）3.0 版进行安全性评价，在每周期治疗后以及结束治疗后每月进行毒性分级。

1.6 统计学分析 该研究主要研究终点为基线血浆VEGF-A，VEGFR-2 和G-CSF 与ORR 的关系。次要研究终点包括标志物与PFS 的关系，标志物水平动态变化。在做统计分析时，用样本的中位浓度二分类为高水平（≥中位值）和低水平（＜中位值）组。然而，外周血中G-CSF 实际检测水平较低，以标准曲线能检测出最低水平为界，分为高水平（≥39ng/ml）和低水平（＜39ng/ml）组。血浆标志物对ORR 的预测价值采用SPSS 19 版logistic 回归进行分析。Cox 比例风险模型则用来分析血浆标志物和PFS 之间的关系。2 周期治疗后和基线标志物水平的动态变化采用配对样本T检验进行分析。

2 结果

2.1 患者特征 自2016 年11 月至2017 年12 月入组了45 例患者，提供了基线血浆标本。37 例患者提供2周期治疗后的血浆标本。截止2018 年3 月25 日数据冻结。19 例未经治患者予培美曲赛/顺铂联合贝伐单抗治疗；26 例经治患者予培美曲赛联合贝伐单抗治疗。患者基线特征见表1。

2.2 基线血浆标志物和ORR 的关系 研究发现基线低水平G-CSF 比高水平的患者有效率更高；基线高水平VEGF-A 比低水平的患者倾向于更高的有效率；VEGFR-2 的水平高低与有效率无显著相关性（见表2）。

表1 基线特征

2.3 基线血浆标志物和PFS 的关系 三个基线血浆标志物均不能预测PFS 的长短。表3 总结了基线血浆标志物低水平和高水平组患者的PFS、HR 和P 值。

表3 基线血浆标志物和PFS的关系

2.4 血浆标志物的动态变化 患者在2 周期治疗后的血浆VEGF-A 水平比基线有显著升高（见表4）。

表4 血浆标志物动态变化

2.5 疗效 41 例患者可评价有效率，有效率为31.7%，在一线治疗亚组为35.3%，既往经治亚组为29.2%。ITT 人群的PFS为4.97个月（95%CI，3.38～6.56）。一线治疗亚组PFS 为5.21 个月，既往经治亚组的PFS为4.63 个月。截止分析时，有6 例患者仍在接受方案治疗，其中4 例患者给予培美曲塞单药。

2.6 安全性 45 例患者全部纳入安全分析。39 例患者（86.7%）经历了＞1 级的不良反应（AE），最常见的AE 为1/2 级。最多见的血液学AE 是白细胞下降，有14 例患者（31.1%）发生了白细胞下降，其中5 例为3/4 级。最多见的非血液学AE 是疲劳，16 例患者（35.6%）发生了疲劳，其中4 例为3 级。作者也总结了贝伐单抗相关的AE。13 例患者（28.9%）发生了蛋白尿，其中1 例为3 级。10 例患者（22.2%）发生了高血压，其中3 例为3/4 级。10 例患者（22.2%）发生了鼻出血，其中1 例为3 级。3 例患者因为毒副反应停用方案治疗。该研究过程中未出现药物相关的死亡。

3 讨论

本研究探讨晚期非鳞非小细胞肺癌患者中血浆标志物和肿瘤缓解率的相关性。研究发现血浆G-CSF 水平和贝伐单抗治疗有效率有负相关，而血浆VEGF-A水平与贝伐单抗治疗有效率有较强的相关趋势。

具有更多的肿瘤病灶或者更晚期的肿瘤倾向于具有更高水平的循环VEGF-A，表明VEGF-A 水平可能反映了肿瘤负荷。多个研究已经证实了血浆VEGF-A在肺癌中的预后价值［7］。循环VEGF-A 水平越高可能预示肿瘤的血管生成越依赖VEGF 通路。在ECOG 4599 研究提示更高水平的VEGF-A 与更高的缓解率相关［4］。而ABIGAIL 研究则发现基线低水平VEGF-A和更长的PFS 和总生存相关，VEGF-A 高水平组患者有效率有更高的趋势［5］。本研究则表明VEGF-A 高水平组患者倾向于更高的有效率和更长的PFS。血浆VEGF-A 对贝伐单抗疗效的预测研究结果不一致，可能的原因在于：首先，不同实验室方法和分析有不同的标准和敏感性；其次，核糖核酸的剪接方式不同，血浆中存在短亚型和长亚型，往往VEGF-A165 水平最高。采用新型酶联免疫吸附试验方法检测，短亚型比长亚型需要更高的敏感性。最后，不同研究用了不同的抗凝剂处理血标本。早期的研究用的柠檬酸钠抗凝剂，而近期的研究用的是EDTA 抗凝剂。

本研究未发现VEGFR-2 和疗效的相关性。此结果与ECOG 4599 研究的标志物分析［4］以及ABIGAIL研究结果一致［5］。虽然VEGFR-2 在调节肿瘤血管生成中扮演了重要的角色［8］。本研究发现在2 周期贝伐单抗治疗后血浆VEGF-A 和VEGFR-2 均有一定程度的升高。循环中游离的VEGF-A 会与贝伐单抗结合，难以鉴别游离或结合的VEGF-A。

肿瘤的血管生成是一个错综复杂的信号网络。而G-CSF 在调动血液干细胞、前体细胞以及成熟细胞释放入外周血循环来刺激肿瘤的血管生成中扮演了重要的角色［9］。G-CSF 是耐药相关的旁分泌信号网络中的一员，通过核因子κB 和细胞外信号调节激酶信号来促进耐药的产生［6］。动物模型表明耐药肿瘤表达了更高水平的G-CSF。本研究首次在临床上分析了血浆G-CSF 在抗血管生成治疗中的作用。然而本研究发现部分患者的血浆G-CSF 水平太低以至于检测不到。本研究发现血浆G-CSF 低水平的患者相比水平高的患者具有更高的缓解率。说明G-CSF 可能是抗VEGF 治疗耐药的一个决定因素。但未发现G-CSF 水平与PFS 相关，可能因为研究入组了初治和经治患者，导致了时间终点的复杂性。

总之，肿瘤血管生成的复杂性和方法学的不确定性，导致难以确立预测贝伐单抗疗效的标志物。本研究结果与既往研究类似，未发现VEGF-A 和VEGFR-2的预测价值。本研究新颖之处在于从耐药入手，创新性检测了G-CSF，分析了G-CSF 和疗效的相关性，初步结果表明G-CSF 能一定程度上预测贝伐单抗耐药，为进一步探讨预测贝伐单抗耐药性生物标志物提供了初步基础和研究方向。