三七总皂苷对炎性内脏痛大鼠星形胶质细胞的影响及其作用机制

吴建跃 王卫民 徐海松 张眉 程军

内脏痛（Visceral Pain，VP）是最为常见的疼痛类型之一，主要为刺激内脏器官而产生疼痛，如心、肝、脾、肾、膀胱等疼痛［1］。内脏痛患者常需要承受身体及心理上的双重痛苦，生存质量明显降低，如何防治内脏痛一直以来是临床上所面临的重要问题［2-3］。随着研究的不断深入，结果发现神经胶质细胞在痛觉信号的产生及传导过程中发挥着重要的作用，星形胶质细胞（Astrocyte，AST）为机体最大的神经胶质细胞，被激活后可导致多种炎症因子分泌增加，参与形成和维持痛觉过敏和触诱发痛等中枢敏化过程［4］。三七总皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是中药三七的主要成分，具有多种生物疗效，如活血化瘀、改善微循环、降低缺血再灌注、抑制心肌细胞凋亡等［5-6］。为进一步探讨AST 在内脏疼痛中的作用及其机制，本实验拟通过对SD 大鼠腹腔注射PNS 或者NS 预处理，然后建立炎性内脏痛模型，通过注射PNS 和NS 对比，并探究不同组别GFAP 及RAS 蛋白的表达变化，进而考察三七总皂苷对炎性内脏痛大鼠星形胶质细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物：本次研究的实验动物为健康大鼠30 只，均为雄性，体重200～300g。清洁级，由北京实验动物中心提供，饲养于无菌、恒温及暗明交替的清洁级环境中（明暗各12h），自由饮食饮水，适应性饲养7d，使其适应环境，避免外界刺激。（2）实验仪器与试剂：①主要试剂：无菌生理盐水（厂家：潍坊中汇有限公司）；冰醋酸（厂家：山西锦洋药用辅料有限公司）；三七总皂苷（厂家：云南三七科技有限公司）。②主要仪器：高速低温离心机（厂家：Sigma公司）；多功能酶标仪（厂家：TECAN）；蛋白电泳仪（厂家：伯乐）；荧光成像系统（厂家：Odyssey CLx）。

1.2 方法 （1）分组及给药：大鼠随机分为对照组（n=6）、生理盐水组（n=12）、三七总皂苷组（n=12）。对照组的大鼠不进行处理，生理盐水组及三七总皂苷组的大鼠预先腹腔给药14d，每隔12h 腹腔注射，三七总皂苷预处理组每只腹腔注射7mg/ml 的三七总皂苷和生理盐水溶液2.86ml/kg，生理盐水预处理组每只腹腔注射2.86ml/kg。（2）炎性内脏痛模型的建立：第15 天建立大鼠疼痛模型，将小鼠放置于干净透明的箱子中，注射1ml 1%醋酸建立急性腹膜炎模型。观察大鼠的扭体反应，处死大鼠，观察其相关指标。（3）RAS 检查：采用western blot 检测RAS 的含量，具体步骤如下。①每20～50mg 组织加入1ml 预冷的RIPA Buffer 低温研磨（研钵提前放入液氮预冷）。使用前在每1ml 预冷的RIPA Buffer 加入10µl 磷酸酶抑制剂，10µl 蛋白酶抑制剂混匀。冰上保存数分钟待用。②置于4℃摇床平台上，中速（100～150rpm）振荡1h。14000rpm（15450g），4℃离心20min，取上清液为全蛋白提取物，蛋白定量和其他蛋白质相关实验。③聚丙烯酰胺凝胶电泳：15%丙烯酰胺胶电泳，蛋白上样量30～50µg。④转膜：湿转30～100min。⑤封闭：5%脱脂奶粉室温封闭1h。⑥孵育一抗：4℃孵育一抗过夜，抗体稀释比例：β-actin（1 ∶10000）；RAS（1 ∶5000）。⑦孵育二抗：羊抗兔二抗（1 ∶10000），羊抗鼠二抗（1 ∶10000）。⑧Odyssey CLx 显影。（4）GFAP 检测：采用免疫组织化学法检测小鼠脊髓 GFAP表达情况，具体步骤如下。①挑选脊髓切片，进行漂洗。②PBS 漂洗结束后，置脱色摇床中。③加一抗 GFAP（1 ∶1000），孵育2h 后，4℃过夜。④加羊抗鼠二抗（1 ∶200），孵育2h。⑤PBS 漂洗后，加三抗。⑥洗涤、脱水、封片。⑦观察、计算。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用独立样本t 检验；计数资料以%表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扭体次数 扭体反应能够在一定程度上反应大鼠的疼痛程度，建立模型1h 后，观察并记录两组大鼠的扭体次数，对照组的大鼠未出现扭体现象，生理盐水组大鼠的扭体次数为（103.5±7.8）次，三七总皂苷组大鼠的扭转次数为（67.6±10.6）次。与对照组比较，生理盐水组及三七总皂苷组大鼠扭体次数明显增加，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；与生理盐水组比较，三七总皂苷组大鼠的扭转次数明显减少，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 RAS 表达 对三组大鼠体内RAS 表达水平进行研究分析，与对照组比较，生理盐水组（NS+HAc+NS）及三七总皂苷组（PNS+HAc+PNS）大鼠的RAS 水平明显上升，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；与生理盐水组比较，三七总皂苷组大鼠RAS 含量明显降低，且差异具有统计意义（P＜0.05），具体结果见图1。

2.3 GFAP 表达 对三组大鼠的腰骶膨大段脊髓GFAP表达水平进行研究分析，与对照组比较，生理盐水组及三七总皂苷组大鼠的GFAP 水平明显升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；三七总皂苷组大鼠的GFAP 水平明显低于生理盐水组，且差异具有统计学意义（P＜0.05），具体结果见图2。

图1 三组大鼠RAS表达情况

图2 三组大鼠GFAP表达情况

3 讨论

GFAP 为星形胶质细胞的标志性蛋白，具有一定的特异性，当机体受到侵损时，星形胶质细胞大量释放，GFAP 含量明显升高，参与神经损伤性疼痛［7］。RAS为神经递质或神经调节因子参与脊髓痛觉的形成，为疼痛治疗的新靶点。本次研究中，建立了疼痛模型的大鼠RSA、GFAP 含量明显升高，与生理盐水组比较，三七总皂苷组的大鼠RSA、GFAP 含量明显降低，且差异具有统计学意义。0.6%～9%的冰醋酸可引发大鼠内脏痛而产生扭体反应，且扭体的次数与疼痛的程度关系密切，其中1%的冰醋酸所引发的大鼠扭体反应较为稳定，故通常选择该浓度的冰醋酸建立大鼠内脏疼痛模型，在本次研究中，大鼠内脏疼痛模型建立成功。

三七总皂苷为三七的主要活性成分，具有多种药理作用，被应用于多种疾病的治疗过程中。近年来研究表明三七总皂苷具有抑制星形胶质细胞活性、促进神经原恢复的作用，表现出一定的镇痛作用。在本资料中，对三组大鼠的扭体反应、RAS、GFAP 水平进行了考察，结果表明三七总皂苷能够显改善大鼠内脏疼痛，这可能与抑制星形胶质细胞的活性有关。综上所述，三七总皂苷在内脏痛的治疗过程中具有良好的效果，能够显著降低临床表现，改善相关症状。三七总皂苷在镇痛方面具有较大的应用价值，值得应用及推广。