妊娠期高血压病中医证候与体质分布及循环MicroRNA的研究

熊智慧 王欣晨 官海涟

妊娠期高血压疾病（Hypertensive disorder of pregnancy，HDP）是妊娠期特有疾病，发生率为5%～15%［1］。目前其病因和发病机制仍未明确，西医主要的治疗方法是解痉降压、适时终止妊娠等对症治疗，但这也是引起围产儿并发症和病死率上升的主要原因［2］。中医将整体观和辨证施治相结合，从未病先防、既病防传的中医思想入手，在改善妊娠期高血压疾病患者的妊娠结局及长期预后方面有所突破［3］。近年来，关于MicroRNA与妊娠期高血压疾病研究也逐渐增多［4-5］。但目前临床仅有少量研究显示妊娠期高血压疾病与中医证型、中医体质分布情况以及相关MicroRNA的研究。本资料通过长期临床观察和总结，将进一步研究其中医证候与中医体质分布情况，并通过明确、量化的科学手段对妊娠期高血压疾病证候变化的血液MicroRNA进行检测，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月至2018年12月在本院产科就诊的298例妊娠期高血压疾病患者以及30例正常妊娠孕妇，对其年龄及孕周匹配。因妊娠期高血压、子痫前期和子痫与慢性高血压在发病机制及临床处理上均不同，本研究只纳入前三种疾病。即妊娠20周后出现收缩压≥140mmHg和（或）舒张压≥90mmHg，伴有或不伴有24h尿蛋白≥0.3g，或随机尿蛋白（+）。所有的参与者均签署书面知情同意书，并得到本院伦理委员会的批准。诊断、纳入及排除标准：诊断标准西医诊断标准参照中华医学会妇产科分会制定的《妊娠期高血压疾病诊治指南（2015年）》［6］，中医诊断标准参照张玉珍主编的十一五规划教材第七版《中医妇科》及《中药新药治疗妊娠期高血压疾病的临床研究指导原则》［7］，对妊娠期高血压疾病进行中医辨证分型及中医症状分级量化。纳入标准：符合上述中西医诊断标准：能够如实回答调查者的问题，在知情同意情况下自愿参与调查。上述2个标准全部符合方可纳入。排除标准：慢性高血压患者；不符合纳入标准者；合并有其他内外科疾病及妊娠期特有疾病患者。上述3个标准有任何1个或以上符合即可排除。

1.2 方法 主要采用问卷调查获得一般资料，中医诊断获得四诊信息以及根据相关量表判定中医证候及体质类型，并采用荧光定量qRT-PCR技术检测血液中MicroRNA中的表达，最后统计分析妊娠期高血压疾病患者中医证候和中医体质的分布及血液中MicroRNA的表达情况。（1）中医证候评定标准：根据《中医妇科学》中妊娠期高血压疾病的中医证候分型和近20年有关中医治疗妊娠期高血压疾病的现代文献进行统计分析的数据，初步将该病分为脾虚湿盛证、肾虚水泛证、脾虚肝旺证、阴虚肝旺证。但在临床辨证时调查者可按中医临床辨证标准，如实辨证分型并注明具体的辨证分型。经由＞3名中医专家讨论辨证，得出每人的中医证候类型。（2）中医体质判定标准：参照2009年中华中医药学会制定的中医体质分类与判定标准，将中医体质分为平和质、气虚质、阳虚质、阴虚质、痰湿质、湿热质、瘀血质、气郁质、特禀质9个类型，根据量表5级评分计算并转化分数。（3）中医证型和相关循环MicroRNA的测定：①标本的采集与保存：患者在入组后次日清晨空腹抽取肘静脉2ml，置于真空采血管（EDTA-K3抗凝管）中。样品经4℃，3000r/min离心15min，取血浆，每500μl分装至无核糖核酸的EP管中，-80℃冰箱储存，用于microRNA检测。②血清miR-885-5p，miR-26a-5p，miR-155，miR-210的检测：采用荧光定量qRT-PCR技术进行检测，具体过程为：依据miRBASE（http：//www.mirbase.org/）数据库4种MicroRNA的序列，设计特异性PCR扩增引物；采用Qiagen公司的血清试剂盒，对血浆总RNA进行提取；利用NanoDrop2000分光光度计（Thermo Scientific，USA）测定浓度及OD260/OD280；配置逆转录反应体系，利用miScriptⅡ Reverse Transcription Kit将待测RNA逆转录成cDNA。利用SYBR GreenI Master试剂盒在Light Cycler 480Ⅱ型荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR检测。具体过程：配置PCR仪上进行荧定量PCR检测。具体过程：配制PCR反应体系；预变性：95℃10min；高温变性：95℃下10s；低温退火与延伸：60℃下30s；高温变性、低温退火与延伸进行40个循环；从60℃缓慢升温至97℃，每摄氏度采集5次荧光信号。记录测定达成所设定的阈值时所经历的循环数即Ct值；利用溶解曲线检测引物的特异性。表达量的计算采用 2-△△Ct法。△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因，△△Ct=△Ct实验组样品-△Ct对照组样品，相对表达量 =2-△△Ct=2-（△Ct实验组样品-△Ct对照组样品）=2-△Ct实验组样品/2-△Ct对照组样品。具体计算时以对照组表达量为1，则比值即为实验组的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件。采用多元回归分析、χ2检验、方差分析等方法进行分析与归纳。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组临床资料比较 见表1。

表1 各组临床资料比较（）

表1 各组临床资料比较（）

注：与妊娠期高血压比较，*P＜0.05；与重度子痫前期比较，#P＜0.05；与轻度子痫前期比较，▲P＜0.05

重度子痫前期（n=69）年龄 27.70±2.95* 30.36±4.49# 30.64±5.54# 33.57±4.38▲孕周（周） 37.13±1.11# 38.49±1.30▲ 37.68±1.94# 36.42±1.94*初产妇（n） 25 128 62 46经产妇（n） 5 20 19 23单胎（n） 26 145 74 64双胎（n） 4 3 7 5 SBP（mmHg） 124.92±3.24* 145.60±1.79# 157.17±5.83 158.65±5.01▲DBP（mmHg） 74.99±2.40* 95.72±1.67# 97.95±3.39 98.70±4.70▲尿蛋白（g/24h） 0.05±0.02* 0.18±0.10* 0.85±0.40# 5.50±3.52▲组别 正常组（n=30）妊娠期高血压（n=148）轻度子痫前期（n=81）

2.2 妊娠期高血压疾病患者中医证候分布情况 见表2。

表2 298例妊娠期高血压疾病中医证型构成统计（n）

2.3 妊娠期高血压疾病患者中医体质分布 见表3。

表3 妊娠期高血压疾病患者中医体质分布

2.4 妊娠期高血压疾病患者中医证候与体质的相关性分析 见表4。

2.5 正常组及妊娠期高血压疾病患者中医证型循环MicroRNA表达的比较 见表5。

3 讨论

体质是在先天与后天基础上表现出的机体形态结构和生理机能相对稳定的特质，代表机体发病的内环境。证是机体正邪交争的动态性、阶段性的病理概括。体质是证的基础，证是致病因素作用于人体体质以后形成的临床类型。本资料调查显示，不同的体质证型决定了临床疾病的严重程度，妊娠期高血压、轻度子痫前期及重度子痫前期与其体质具有显著差异（P＜0.01），其中以气虚质及阴虚质关系最为密切，妊娠期高血压在临床上多表现为脾虚湿盛型和脾虚肝旺型，而轻度子痫前期及重度子痫前期多表现为脾虚肝旺型和阴虚肝旺型，说明不同体质差异对妊娠期高血压疾病的证型影响有明显差异，并决定了疾病的临床表现形式。

表4 特定证候类型患者体质类型分布［n（%）］

表5 正常组及妊娠期高血压疾病患者中医证型循环循环MicroRNA的表达

先天体质是中医证型形成的基础，中医证型必然表现各自体质的特点，而随着现代分子生物学的发展，逐步研究发现了基因表达差异会造成许多疾病不同个体间的差异，中医证型可能与基因有密切地联系，临床上证型相同的患者可能存在较为一致的病理改变及相同的基因变异［8］。近年来研究发现MicroRNA参与了妊娠期高血压疾病的演进，是妊娠期高血压疾病发生、发展的重要分子，其中miR-885-5p，miR-26a-5p，miR-155，miR-210逐步受到关注［9］。本次调查发现，妊娠期高血压疾病患者血液中检测到的miR-885-5p及miR-26a-5p分别在阴虚肝旺型和脾虚肝旺型表达中有显著差异（P＜0.01），而肾虚水泛型患者血液中检测到的miR-155、miR-210表达水平显著高于其他证型组（P＜0.01）。由此可以推断，证型的出现可能是机体对不同的分子病理所作出的反应，也可能提示妊娠期高血压疾病发展过程中证型的转变预示疾病不同的病理改变，当机体出现脾虚湿盛证型时，常见为妊娠期高血压患者，临床表现主要以血压的轻度升高为主；而随着疾病的演变和进展，当机体出现脾虚肝旺及阴虚肝旺证型时，常见为子痫前期患者，临床表现除了血压升高外，还伴有机体其他脏器不同程度的受累，而其内在机制可能与血液中MicroRNA的调控有关，提示妊娠期高血压疾病患者血液中MicroRNA的表达水平与中医证型及中医体质存在一定的联系。

本次调查在对妊娠期高血压疾病中医证型分布和中医体质及循环MicroRNA的探讨中，尚缺乏大样本、多中心的研究调查，对其辨证分型存在一定主观因素，同时，本次调查只是对临床上常见的证型进行了初步的探讨，下一步需要扩大样本量，进一步全面分析中医证型和中医体质及循环MicroRNA的关系，揭示中医证型的实质和科学内涵，为中医辨证客观化研究提供依据。